專利名稱：一種新型抗原檢測方法及利用該方法制成的檢測裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型抗原檢測方法，具體涉及一種利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基建立的抗原檢測方法。本發明還涉及利用該方法制成的檢測裝置。
背景技術：
抗原檢測是通過抗體對抗原分子上特異決定簇的有效識別來實現的。抗原檢測，特別是蛋白質的高靈敏度檢測對醫學研究、后基因組計劃的完成及臨床檢驗具有非常重要的作用。目前，特異識別抗原的常用技術是ELISA(酶聯免疫吸附試驗)，它是通過特異抗體識別抗原決定簇，并通過連接于抗體上的酶、熒光物質、放射性同位素來完成抗原信息的識別、放大，從而實現檢測目的。近年來，雖然ELISA檢測方法有了很大的發展，但是，當檢測樣品量有限、抗原濃度極低或抗體效價不高時，就無法用傳統的ELISA技術進行檢測。
隨著PCR擴增技術的出現，Santo等在1992年建立了免疫PCR技術(Santo，T.，et al.Science.258120-122)。免疫PCR技術和ELISA的基本過程相似，只是用連接蛋白將一段可擴增的生物素標記的DNA分子連接在抗體Fc片段上，并通過PCR技術將抗原信號放大、檢出。連接蛋白是鏈霉親和素-蛋白A復合物，它具有兩個專一結合位點一個是由鏈霉親和素衍生而來的生物素位點，另一個是由蛋白A衍生而來的Fc片段結合位點。DNA片段是生物素化的線性質粒DNA(pUC19)。抗體是正常抗體。檢測過程是將連接蛋白和生物素化的DNA pUC19以1∶1的摩爾比混合，產生嵌合蛋白-DNApUC19聚合物，再通過連接蛋白上蛋白A位點與抗體Fc段結合，形成抗體-連接蛋白-DNA片段的復合體。檢測時，通過抗原和抗體結合實現抗原-DNA信號轉換，再通過PCR擴增將抗原信號放大。免疫PCR技術能夠檢測出580個抗原分子，靈敏度比用堿性磷酸酶作為標記物的傳統ELISA技術提高了105倍。但是免疫PCR技術存在以下問題由于連接蛋白的存在，檢測時產生較強的本底信號(因為蛋白A基團可與樣品中的任何抗體IgG的Fc片段進行結合)；連接蛋白未商品化；不能同時進行多分子檢測。
1995年Hendrickson等(Hendrickson，ER，et al.Nucleic Acids Res.1995，23522-529)改進了免疫PCR技術。它是用雙功能化學交聯分子取代了連接蛋白，將寡核苷酸與抗體的Fc片段進行共價結合，使檢測背景減少，靈敏度進一步提高。Schweitzer等2000年建立的免疫RCA技術(Rolling circleamplification)(Schweitzer，B，et al.PNAS 2000，9710113-10119)，基本原理與Hendrickson等在1995年改進的免疫PCR技術基本相同，所不同的是連接的寡核苷酸最后以滾環復制的方式擴增，使檢測靈敏度進一步提高。以上兩種改進的免疫PCR技術都必須使用交聯分子，而且交聯前需活化抗體的Fc片段及寡核苷酸結合位點，因此在檢測過程中操作難度大、易使抗體活性喪失；操作還只能在高純度抗體的條件下進行，且針對每一種抗體都須與DNA分子進行連接，費時、成本高，普及應用都比較困難。

發明內容
本發明的目的是提供一種利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基建立的抗原檢測方法。
本發明的另一目的是提供一種利用該方法制成的檢測裝置。
本發明的方法不需要任何連接蛋白或交聯分子，而是利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基與抗體的直接結合，將抗原信號轉換成核酸信號，然后經PCR擴增放大，檢測出新型抗原。
本發明所稱的特異寡核苷酸配基包括能與抗體Fc片段特異結合的任何形式的寡核苷酸，常用的有單鏈DNA和單鏈RNA。
為增加其穩定性，本發明所稱的特異寡核苷酸配基序列中的堿基可經化學修飾。也可以如在不改變與Fc片段結合特性的前提下，在配基序列兩端增加一些堿基，使通用序列變為攜帶大量人為信息的多樣性配基，以滿足同時檢測多種抗原的需要。
本發明所稱的特異寡核苷酸配基序列可經SELEX技術篩選獲得或通過其他的方法如分子生物學、生物信息學的方法獲得。
本發明所稱的抗體可以是任何種屬(如人、兔、小鼠、雞、羊等)、任何種類(如IgG、IgM、IgE等)、任何來源(如動物產生、基因工程制備等)的單克隆抗體或多克隆抗體或基因工程單鏈抗體。
本發明的方法的原理和技術路線是將待測抗原固定在硝酸纖維素膜等介質上，用封閉液封閉后，將膜與抗體及經SELEX技術篩選獲得的同類抗體Fc片段的特異寡核苷酸配基孵育一定時間，用洗滌液充分洗滌纖維素膜，將未結合的特異寡核苷酸配基及游離抗體除去，利用PCR技術擴增與抗原結合的抗體Fc片段上的寡核苷酸配基。PCR擴增所用引物同時標記有熒光試劑或同位素，通過檢測熒光或同位素的強度實現抗原信號檢測。
本發明強調的是該抗原檢測方法中抗體與寡核苷酸配基之間無任何連接分子。
因為某一類抗體Fc片段的寡核苷酸配基為該類抗體的通用性配基，應能識別該類所有的抗體，所以通過上述方法，以針對該通用配基的特異核酸序列為引物，可將該類抗體識別的所有抗原信號都轉換成核酸信號加以放大、檢測。
將某一類抗體Fc片段通用寡核苷酸配基核酸序列人為修飾后(如末端人為加上一些不影響其結合活性的核酸序列)，先與特定抗體結合并通過紫外交聯等方法加以固定，即成為針對不同抗原的特定的核酸標記抗體。根據修飾序列長短不同，堿基序列不同，可使通用寡核苷酸配基成為代表不同抗原的多樣性配基，可構建微陣列或生物芯片，利用上述原理完成多種抗原的同時檢測。
本發明所指的寡核苷酸可以是ssDNA，也可以是RNA。通過SELEX篩選出序列后，可以直接化學合成或通過其他分子生物學的方法獲得。
本發明是利用SELEX技術篩選抗體Fc片段的高親合性寡核苷酸配基(包括單鏈DNA和RNA)，通過寡核苷酸配基對Fc片段的特異性識別、直接結合(中間不需要任何連接分子)及PCR擴增，實現抗原信息的有效傳遞和放大。
本發明的新型抗原檢測方法在各種抗原檢測方面有廣泛的應用。例如，1.利用該技術原理可以建立一種新型抗原檢測方法平臺；2.利用該技術原理組裝成檢測試劑盒，能夠快速高效的提高現有各類抗體免疫檢測的靈敏度、特異性；3.利用該技術原理可以發展成一種新型實用蛋白質芯片或其他各類抗原檢測生物芯片構建技術；4.利用該技術組裝的檢測試劑盒或構建的生物芯片可以廣泛應用于基礎研究與臨床檢測，并帶來可觀的經濟效益與社會效益。
本發明的方法具有以下幾方面的優點1)高靈敏度與抗體Fc片段特異結合的寡核苷酸是利用SELEX(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment)技術篩選出來的。SELEX技術是近些年發展起來的一種新型生物學技術(綜述見孫蕾等，指數式富集法配體進化-組合化學技術的新進展，國外醫學藥學分冊，1999，26193-197)。它是應用大容量(庫容量可達1018)的隨機寡核苷酸文庫，并結合PCR體外擴增技術以指數級富集與靶分子特異結合的寡核苷酸配基(aptamer)。用此方法篩選出的特異寡核苷酸配基與靶分子結合的親和力高(Kd為0.05～50nmol.L-1)、特異性強、易形成穩定的復合物。本發明利用Fc片段特異寡核苷酸配基與抗體的直接結合及PCR技術檢測抗原，不但保留了免疫PCR和免疫RCA利用寡核苷酸擴增、傳遞、放大抗原信號的優點，而且由于抗體對Fc片段的特異性識別與結合，避免了連接分子的存在，使得抗原信號的檢測背景非常低，特異性更強，靈敏度會大大提高；2)抗體的通用性識別由于抗體的Fc片段是高度保守序列，因此針對某種屬的某一類抗體(如小鼠IgG、IgE、IgM等)Fc片段篩選出的特異寡核苷酸配基，應能識別該類所有的抗體，作用類似于ELISA中的酶標二抗；3)可進行多種抗原超微多樣性檢測通用的寡核苷酸配基經過人為序列修飾后，使寡核苷酸配基不僅具有通用性，同時也能形成識別不同抗原的多樣性配基，并可構建成微陣或生物芯片用于多種抗原的同時檢測；4)操作簡便，易于普及由于獲得的特異寡核苷酸配基與抗體及抗原孵育一定時間后，將未結合的核酸配基除去，即可通過PCR技術檢測，不需要將寡核苷酸配基經過化學方法偶聯到抗體蛋白分子上，因此操作簡便，便于一般實驗室或臨床檢驗科室的普及應用。


圖1是利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基建立的新型抗原檢測方法原理示意圖。其中PCR所用引物為針對寡核苷酸配基的互補序列。
圖2是某一類抗體Fc片段通用特異寡核苷酸配基序列經人為增加一些堿基后，變成多樣性配基序列用于多種抗原同時檢測示意圖。為了增加配基的多樣性，人為序列可以加在5’端、3’端、或5’端和3’端同時加上，長度可以多樣。其中PCR所用引物只針對寡核苷酸配基兩端人為添加序列。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例1.單一抗原的免疫檢測利用小鼠IgG Fc片段特異寡核苷酸配基制備小鼠IgG類單抗核酸標記試劑，并以此為傳感器檢測該類抗體識別的抗原。具體方法如下將抗原固定在硝酸纖維素膜上，封閉液封閉后，將膜與小鼠IgG類單抗及小鼠IgG Fc片段特異寡核苷酸配基在37口下共同孵育30分鐘，用洗滌液洗滌濾膜數次后，將濾膜重新置于含有PCR反應液(包括引物及標準PCR反應體系)的薄壁PCR管中，進行PCR擴增。利用引物上標記的熒光試劑檢測熒光信號，同時設立相應未進行PCR擴增(相應試劑都存在)的對照。扣除對照熒光信號即為待測抗原的信號。
實施例2.用于原發性肝癌早期診斷新型免疫微陣列的制備及其應用具體步驟如下1.制備AFP(甲胎蛋白)、Ft(鐵蛋白)、GGT(γ-谷氨酰轉肽酶)及GGT同功酶的特異核酸標記抗體由于目前臨床所用上述4種抗體皆為小鼠IgG類單抗，所以將小鼠IgG抗體Fc片段通用寡核苷酸配基的核酸序列進行人為修飾，如在5’末端分別人為加上4種不影響其結合活性的核酸序列A、B、C、D，長度40-80bp，即成為4種特定的標記核酸。將這4種不同的標記核酸分別與上述4種抗體一一對應結合，通過紫外交聯加以固定，即成為針對4種不同抗原的特定的核酸標記抗體。
2.按目前常規方法制備針對上述A、B、C、D序列的微陣列。
3.將抗原(如患者血清)固定在硝酸纖維素膜上，封閉液封閉后與上述4種不同核酸標記抗體在37口下共同孵育30分鐘，用洗滌液沖洗濾膜數次后，將濾膜重新置于含有PCR反應液(包括引物及標準PCR反應體系)的薄壁PCR管中，進行PCR擴增。所用引物分別為針對上述A、B、C、D4種人為序列(即同時存在8種引物)，引物上同時標記有熒光試劑。用微陣列技術對PCR產物進行定性定量分析，即可檢測4種抗原，從而對原發性肝癌進行早期診斷。
權利要求
1.一種新型抗原檢測方法，其特征是利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基與抗體直接結合，將抗原信號轉換成核酸信號，然后經PCR擴增放大，檢測出抗原。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于所說的特異寡核苷酸配基是能與抗體Fc片段特異結合的單鏈DNA。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于所說的特異寡核苷酸配基是能與抗體Fc片段特異結合的單鏈RNA。
4.權利要求1所述的方法，其特征在于所說的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或基因工程單鏈抗體。
5.權利要求2至3所述的方法，其特征在于在不改變與Fc片段結合特性的前提下，配基序列兩端可人為地增加一些堿基，使通用序列變為攜帶大量人為信息的多樣性配基，以滿足同時檢測多種抗原的需要。
6.利用權利要求1所述方法制成的檢測試劑盒及裝置。
全文摘要
本發明涉及一種新型抗原檢測方法。該方法利用抗體Fc片段特異寡核苷酸配基與抗體直接結合，將抗體信號轉換成核酸信號，然后經PCR擴增放大，檢測出抗原。利用該方法可以組裝成檢測試劑盒或開發成為實用蛋白質芯片或其他檢測各類抗原的生物芯片。該方法檢測抗原具有快速、高靈敏度、特異性強等特點。
文檔編號G01N33/53GK1428606SQ0114492
公開日2003年7月9日 申請日期2001年12月24日 優先權日2001年12月24日
發明者邵寧生, 廖世奇, 柳川, 薛沿寧, 沈倍奮, 楊光, 何曉東, 劉元強, 仇杰, 董信春 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所, 甘肅省醫學科學研究院