專利名稱：一種尿液中核苷的測定方法及在惡性腫瘤診斷儀中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及色譜分析技術，特別提供了一種通過高效毛細管電泳從尿液中測定核苷的方法，用于惡性腫瘤的輔助性診斷儀。
尿中修飾核苷已被作為癌癥和艾滋病的潛在診斷標記物進行研究。核糖核酸(RNA)特別是轉運核糖核酸(tRNA)中除含有四種正常核苷腺嘌呤核苷(A)、鳥嘌呤核苷(G)、胞嘧啶核苷(C)、尿嘧啶核苷(U)外，還有大量修飾核苷。現已發現有90多種修飾核苷，其中tRNA中已發現79種，其它來自于mRNA和rRNA中。所有修飾核苷是在大量高度特異性的修飾酶的作用下，尤其是甲基轉移酶和連接酶的作用下，RNA鏈上特定位置的核苷被修飾如堿基甲基化、碳氮鍵發生重排、尿苷移位形成假尿苷等。轉錄修飾完成之后，RNA分子在核酸酶作用下釋放出各種核苷。血中正常的未被修飾的核苷可以在酶的作用下，被磷酸酯化后再利用形成新的RNA，或降解為尿酸和β-丙胺酸。而修飾核苷十分穩定，既不易代謝也不能被磷酸酯化再利用，因此在尿中被定量排放。所以，在尿中，修飾核苷的含量相對來說比正常核苷的含量會稍高一些。但無論如何，對正常的成年人來說，個體間排放濃度差異較小，分布在一個較窄的范圍。當人體的某一部分發生癌變時，核糖核酸周轉加快，導致尿液或血液中修飾核苷的含量急劇增加。根據以上的機理，人們可以通過尿液或血液中修飾核苷濃度的增加程度，對癌癥的發病進行早期診斷。
分析尿液或血液中的修飾核苷，可以采用高效液相色譜法(HPLC)，同時還有免疫分析法、氣相色譜法。
氣相色譜法通常能提供很高的分辨率，但受揮發性的限制，即使經過了化學衍生，也無法檢測象t6A和Q這樣的修飾核苷。
目前臨床應用的腫瘤標記物分析儀，主要是基于免疫化學的方法，以分析血清中的某些蛋白質類腫瘤標記物來輔助癌癥診斷，一次只能分析一種腫瘤標記物，癌癥是一個非常復雜的疾病，它由多基因引起，并由多步驟控制，單靠一二種標記物很難做到早期發現、準確檢測；另外免疫分析盡管可以在一天內快速分析多個樣品，但是核苷與尿的其它成分會發生交叉反應，也減少了定量分析的準確度。
經典的反相高效液相色譜法(RP-HPLC)，可以一次性分析分離體液中的多個核苷和修飾核苷類腫瘤標記物，信息量大大增多，但是分析柱子比較昂貴，需要經常的維護，使用壽命較短，同時由于RP-HPLC的流動相消耗大量的溶劑，有較多的有機廢液排出，從而增加了分析的成本。
本發明的目的是提供一種尿液中核苷的測定方法，其可以高分辨率地、高選擇性地一次性分析分離尿液的中多個核苷和修飾核苷類腫瘤標記物，從而使核苷類腫瘤標記物輔助癌癥診斷儀器的研制成為可能。
本發明提供了一種尿液中核苷的測定方法，采用毛細管電泳技術，首先將帶有內標的隨機尿樣中的核苷預分離富集，其特征在于富集后的分析溶液以200～300mmol/L十二烷基磺酸鈉SDS、10～75mmol/L十水合四硼酸鈉Na2B4O7.10H2O、10～100mmol/L二水合磷酸二氫鈉NaH2PO4.2H2O為緩沖液，pH為6.5-7.2，用未涂層石英毛細管25～75μm.ID為分離通道，在5～15kV電壓和210～280nm檢測波長下進行毛細管電泳分析，測定隨機尿樣中核苷的濃度。
由于尿中多達上萬種化學物質，核苷的含量很低，其它成分的干擾太多，無法直接對樣品進行分析，應采用苯基硼酸親和色譜法預分離和富集尿中核苷。本發明所述預分離富集的過程是，將混有3-脫吖尿苷(3-Dzu)作內標的10ml尿樣先通過苯基硼酸柱，經苯基硼酸柱洗脫的溶液，在旋轉真空蒸發器中蒸發至干，再用1mL的Milli-Q超純水溶解作為分析溶液。相比原尿樣中的核苷濃度，萃取后濃縮了十倍。
富集后的核苷用高效毛細管電泳法進行分析。由于在pH 7左右核苷是不帶電的物質，應用膠束電動力學毛細管色譜法。為此，使用SDS作表面活性劑，在硼酸鹽和磷酸鹽緩沖液中對萃取出的尿中核苷進行毛細管電泳分離分析。由于尿液數量受飲食等影響，上述分析最好用24h尿，看一天里病人排放的尿中核苷的總量。但24h尿采集起來又非常不方便。為此，本發明將所述測定的核苷濃度與測定的尿液中肌酐的濃度(creatinine)相除，以獲得一不隨24小時飲食變化的尿液中核苷的標定參量。所述尿液中肌酐的濃度可以用Jaffe法、毛細管電泳法或高效液相色譜法測定。
當所述肌酐濃度用毛細管區帶電泳法測定時，將尿離心后，取10μL用重蒸水稀釋10倍，在毛細管電泳儀上，以0.1mol/L pH為2.5的磷酸鹽為緩沖液，在50μm.ID～75μm.ID的未涂層石英毛細管上，于20kV恒壓，進行電泳分離，檢測波長為214nm，外標法定量。
本發明與經典的反相高效液相色譜法(RP-HPLC)相比有如下優點1)CE使用未涂漬的毛細管柱，比RP-HPLC的柱子更便宜，并且需要更少的維護，有著更長的壽命；2)RP-HPLC的流動相消耗大量的溶劑，而CE由于管徑細，并在電場作用下分離樣品，因此所需流動相和樣品量很小，無有機廢液。
本發明通過通用毛細管電泳儀，配上特定的緩沖液和分析方法，從而高分辨率地、高選擇性地一次性定量分析分離尿液的中多個核苷和修飾核苷類腫瘤標記物。如果將通過本發明方法測得多種腫瘤標記物核苷和修飾核苷的數據，與現代先進的各種多變量數據處理技術——廣義的模式識別技術結合進行數據處理，如因子分析法、人工神經元網絡技術等，可以從高風險人群中篩選惡性腫瘤患者以及區分正常人、良性腫瘤患者和惡性腫瘤患者，從而使核苷類腫瘤標記物輔助癌癥診斷儀器的研制成為可能。
下面通過實施例詳述本發明。
附

圖1為14種標樣核苷組分的電泳圖；附圖2為健康人尿中核苷的電泳圖；附圖3為良性腫瘤患者尿中核苷的電泳圖；附圖4為惡性腫瘤患者尿中核苷的電泳圖；附圖5為健康人與良性乳腺腫瘤病人的多種核苷模式識別基圖。
附圖6為健康人與癌癥病人的多種核苷模式識別基圖。
實施例1應用高效毛細管電泳法—膠束電動力學色譜法，對14種核苷標樣進行分離，分析結果見附圖1。
色譜條件為電泳柱52cm×50μm.id； 真空進樣0.5Psi×15s；溫度29℃；運行電壓7.0kV；緩沖溶液(pH6.96)300mM十二烷基磺酸鈉(SDS)-25mM十水合四硼酸鈉(Na2B4O7.10H2O)-50mM磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)；檢測波長254nm。
圖中色譜峰1.假尿嘧啶核苷，2.尿苷，3.胞啶，4.3-甲基尿嘧啶+5-甲基尿嘧啶，5.次黃嘌呤核苷，6.1-甲基次黃嘌呤核苷，7.N4-乙酰胞苷，8.鳥苷，9.腺苷，10.3-脫吖尿苷(內標)，11.黃嘌呤核苷，12.2-甲基鳥苷，13.6-甲基腺苷。
實施例2應用膠束電動力學色譜法，對正常人的尿中核苷進行測定，結果見附圖2。
色譜條件為電泳柱52cm×50μm.id；真空進樣0.5Psi×15s；溫度29℃；運行電壓7.0kV；緩沖溶液(pH6.96)300mM十二烷基磺酸鈉(SDS)-25mM十水合四硼酸鈉(Na2B4O7.10H2O)-50mM磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)；檢測波長254nm。
圖中色譜峰1.假尿嘧啶核苷，2.尿苷，3.胞啶，4.甲基尿嘧啶，5.次黃嘌呤核苷，6.1-甲基次黃嘌呤核苷，7.N4-乙酰胞苷，8.鳥苷8′.1-甲基鳥苷，9.腺苷，10.3-脫吖尿苷，11.黃嘌呤核苷，12.2-甲基鳥苷，13.6-甲基腺苷。
實施例3應用膠束電動力學色譜法，對良性腫瘤患者的尿中核苷進行測定，結果見附圖3。
色譜條件為電泳柱52cm×50μm.id；真空進樣0.5Psi×15s；溫度29℃；運行電壓7.0kV；緩沖溶液(pH6.96)300mM十二烷基磺酸鈉(SDS)-25mM十水合四硼酸鈉(Na2B4O7.10H2O)-50mM磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)；檢測波長254nm。
圖中色譜峰1.假尿嘧啶核苷，2.尿苷，3.胞啶，4.甲基尿嘧啶，5.次黃嘌呤核苷，6.1-甲基次黃嘌呤核苷，7.N4-乙酰胞苷，8.鳥苷，8`.1-甲基鳥苷，9.腺苷，10.3-脫吖尿苷，11.黃嘌呤核苷，12.2-甲基鳥苷，13.6-甲基腺苷。
實施例4應用膠束電動力學色譜法，對惡性腫瘤患者的尿中核苷進行測定，結果見附圖4。
色譜條件為電泳柱52cm×50μm.id；真空進樣0.5Psi×15s；溫度29℃；運行電壓7.0kV；緩沖溶液(pH6.96)300mM十二烷基磺酸鈉(SDS)-25mM十水合四硼酸鈉(Na2B4O7.10H2O)-50mM磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)；檢測波長254nm。
圖中色譜峰1.假尿嘧啶核苷，2.尿苷，3.胞啶，4.甲基尿嘧啶，5.次黃嘌呤核苷，6.1-甲基次黃嘌呤核苷，7.N4-乙酰胞苷，8.鳥苷，8`.1-甲基鳥苷，9.腺苷，10.3-脫吖尿苷，11、黃嘌呤核苷，12、2-甲基鳥苷。
實施例5分別對正常人、良性腫瘤患者、惡性腫瘤患者和待診斷病人的尿中核苷進行測定，所得結果轉化為nmol/μmol肌酐(creatinine)。肌酐濃度用毛細管區帶電泳法測定。方法為將尿離心后，取10μL用重蒸水稀釋10倍，在毛細管電泳儀上，以0.1mol/L pH為2.5的磷酸鹽為緩沖液，在50μm.ID～75μm.ID的未涂層石英毛細管上，于20kV恒壓，進行電泳分離，檢測波長為214nm，外標法定量。
以上述多種正常核苷和修飾核苷的濃度(nmol/μmol肌酐(creatinine))作數據矢量，用模式識別等數據分類法處理數據，給出可視化的診斷結果。
圖5是正常人(+)與良性病人(x)核苷排放的比較。上述模式基圖通過分析28個正常人和9個乳腺腫瘤病人的尿樣獲得。數據矢量為尿中14種核苷濃度。14種核苷為C，U，A，G，Pseu，I，ac4C，X，m3U+m5U，m1I，m1G，M1G，M2G。可見，良性和正常人尿中核苷的排放模式區別不大。9個病人中只有3個(點)稍稍偏離正常人區域。
圖6是正常人(+)和癌癥病人(x)的模式識別。上述模式基圖通過分析25個正常人和25個癌癥病人的尿樣獲得。數據矢量為尿中14種核苷濃度。14種核苷為C，U，A，G，Pseu，I，ac4C，X，m3U+m5U，m1I，m1G，M1G，M2G。可見正常人和癌癥病人各有一個較明顯的分布區域。正常人分布在一個較窄的范圍，而癌癥病人則較分散。大約有20％的病人(點)進入到正常人的區域，區別率為80％左右。
實施例6對28個正常人尿中核苷排放濃度進行了高效毛細管電泳測定。以此為基礎，可對未知病人進行診斷如果未知病人的尿中核苷排放模式與正常人類似，則視為未發現惡性腫瘤，否則視為陽性，建議其去醫院做更深入的體檢。通過上百例診斷，可靠性大于70％。
本發明采用高分辨率和高選擇性的高效毛細管電泳法用于尿中核苷的測定，然后結合模式識別技術，可以從高危病人中篩選出惡性腫瘤患者，如白血病、淋巴瘤、小細胞肺癌、食道癌、乳腺癌、鼻咽癌、腦癌、支氣管癌、結腸癌、女性卵巢癌等。它提供了一個不“侵入”的診斷惡性腫瘤的方法。應用本發明所提供的方法可以制作急發性惡性腫瘤的診斷儀器。
權利要求
1.一種尿液中核苷的測定方法，采用毛細管電泳技術，首先將帶有內標的隨機尿樣中的核苷預分離富集，其特征在于富集后的分析溶液以200～300mmol/L十二烷基磺酸鈉SDS、10～75mmol/L十水合四硼酸鈉Na2B4O7.10H2O、10～100mmol/L二水合磷酸二氫鈉NaH2PO4.2H2O為緩沖液，pH為6.5-7.2，用未涂層石英毛細管25～75μm.ID為分離通道，在5～15kV電壓和210～280nm檢測波長下進行毛細管電泳分析，測定隨機尿樣中核苷的濃度。
2.按照權利要求1所述尿液中核苷的測定方法，其特征在于所述預分離富集的過程是，將混有3-脫吖尿苷3-Dzu作內標的10ml尿樣先通過苯基硼酸柱，經苯基硼酸柱洗脫的溶液，在旋轉真空蒸發器中蒸發至干，再用1mL的Milli-Q超純水溶解作為分析溶液。
3.按照權利要求1或2所述尿液中核苷的測定方法，其特征在于將所述測定核苷的濃度與測定的尿液中肌酐的濃度(creatinine)相除，獲得一不隨24小時飲食變化的尿液中核苷的標定參量。
4.按照權利要求3所述尿液中核苷的測定方法，其特征在于所述尿液中肌酐的濃度用Jaffe法、毛細管電泳法或高效液相色譜法測定。
5.按照權利要求4所述尿液中核苷的測定方法，其特征在于所述肌酐濃度用毛細管區帶電泳法測定，將尿離心后，取10μL用重蒸水稀釋10倍，在毛細管電泳儀上，以0.1mol/L pH為2.5的磷酸鹽為緩沖液，在50μm.ID～75μm.ID的未涂層石英毛細管上，于20kV恒壓，進行電泳分離，檢測波長為214nm，外標法定量。
6.權利要求1中所述尿液中核苷的測定方法在惡性腫瘤診斷儀器中的應用，其特征在于結合計算機技術，將測得的多種核苷類腫瘤標記物的數據用各種多變量數據處理技術，即廣義的模式識別技術，如因子法、人工神經元網絡技術等結合進行數據處理。
全文摘要
一種尿液中核苷的測定方法,首先將帶有內標的隨機尿樣中的核苷預分離富集,其特征在于:富集后的分析溶液以200～300mmol/L十二烷基磺酸鈉SDS、10～75mmol/L十水合四硼酸鈉Na
文檔編號G01N30/00GK1357762SQ0013430
公開日2002年7月10日 申請日期2000年12月13日 優先權日2000年12月13日
發明者許國旺, 鄭育芳, 路鑫, 劉大漁, 孔宏偉 申請人:中國科學院大連化學物理研究所