專利名稱：用于將溶液排列到固體支持物上的裝置和方法
技術領域：
本發明涉及微型制備技術如DNA-集成片制備技術，并且更具體地涉及用于將可控量的溶液轉移到固體支持物上特定且間距很近的位置的方法和裝置。
背景技術：
在分子生物學和微生物學領域中，長期以來經常需要制備重復排列的生物試劑以利于平行測試多個樣品。例如，長期以來使用無菌絲絨布和活塞環在各含有不同培養基的多個平板上復制細菌和酵母菌落的瓊脂平板作為快速篩選大量獨立菌落的不同生長表型的方法(Lederberg和Lederberg，細菌學雜志63399，1952)。同樣，96孔微量滴定板已長期用于以有組織并且容易應用的方式保存大量細胞系和代表重組DNA文庫的病毒分離物或單克隆抗體細胞系。
對裝有克隆群的96孔微量滴定板的實驗性篩選通常通過使用硬金屬或塑料96針裝置來完成，這種裝置設計成每根針相對于其它針互相間隔開使其準確地與微量滴定板吻合。根據手邊的任務，將96針裝置小心地降低到營養瓊脂板的表面(如果目的是重復培養生物樣品)、到另一微量滴定板中(為培養或稀釋這些樣品)、到尼龍膜上(用于通過DNA或RNA雜交的分子篩選以鑒定特定重組克隆)或被轉移以用于任何適于96孔微量滴定板形式的其它篩選或方法。
當用一個浸入排列于主微量滴定板中的樣品的針進行多次印跡時，在每次連續印跡過程中保存的樣品量下降。控制將溶液吸到印跡針上的能力以及將溶液轉移到印跡表面的能力對于獲得達到基因組、分子生物學和分子診斷學領域微陣列制備技術要求的等分裝置是至關重要的。
開發成功的印跡方法的重要因素是控制針頭接觸待印跡表面時的移動力和速度的能力。正如Drmanac和Drmanac(生物技術17328，335，1994)所觀察到的，用常規平圓柱體針的兩個問題是液滴可能粘附在針的側面從而導致不規則的印跡，并且當印跡針頭從印跡表面太快取出時液滴可能濺射。太大的力可能導致對印跡表面的重大損傷從而對印跡陣列的應用產生負面影響。太小的力也可能是不行的，因為可能轉移不同量的樣品或者印跡總體上可能有缺陷。例如，當將細菌或病毒樣品印跡到營養瓊脂板表面上時，太大的壓力導致瓊脂表面的破壞，而太小的力可能導致樣品極少或沒有樣品轉移。此外，許多核酸雜交膜表面是脆性的并且容易在樣品印跡過程中被太大的針頭力損壞。
大規模基因組計劃的出現和分子診斷逐漸增加的醫學應用促進了大量處理方法的開發以篩選代表完整基因組的重組DNA文庫、進行大規模DNA測序計劃以及進行重復性免疫學分析、核酸雜交分析或聚合酶鏈式反應分析。只是作為例證的以下公開文獻(以及本文引用的參考文獻)提供依賴生物分子陣列的大量處理方法及制備這些排列的方法的總體和具體綜述Eggers，M.D.等，DNA測序技術進展卷SPIE 1891113-126，1993；Chetverin，A.B.等，生物/技術121093-1099，1994；Southern，E.M.核酸研究221368-1373，1994；Lipshutz，R.J.等，生物技術19442-447，1995；Schena，M.BioEssays 18427-431，1996；Blanchard，A.P.等，生物傳感器及生物電學11687-690，1996；O’Donnell-Maloney，M.J.等，遺傳分析生物分子工程13151-157，1996；Regalado，A.Start-Up 24-30，1996年10月和Stipp，D.財富30-41頁，1997年3月31日。
對大處理量方法學的需求在某些情況下已導致96孔微量滴定板形式向384孔(Maier等，生物技術雜志35191，1994)或864孔(Drmanac等，電泳13120，1992)形式的變化，這些形式也可與自動裝置結合使用(參見例如Belgrader等，生物技術19426，1995；Wilke等，診斷微生物學及傳染病21181，1995)。然而，所有這些自動化技術需要使用能可重復地從一種陣列形式(即96孔微量滴定板)向另一種陣列形式(雜交濾膜上的96點陣列)轉移等體積液體的自動針附件裝置。
最近，已經開發出合成大批與玻璃表面結合的代表所有或部分可能核苷酸序列的短寡聚核苷酸(ODN)的方法(Maskos和Southern，核酸研究.201675，1992)。一旦這樣的ODN陣列得到制備，就可用于通過雜交進行DNA測序(Southern等，基因組131008，1992；Drmanac等，科學2601649，1993)。如果存在轉移和排列準確量的、合成與可雜交表面結合的大量ODN所需的生化試劑的更好方法，那么這種DNA測序方法的效用將得到大大改善。這將確保陣列內每個位置更加相同的ODN產量并且也增加可能合成的寡核苷酸鏈長度。
已發現聚合酶鏈式反應(PCR)在許多不同生物學問題上的廣泛應用。PCR商業利用的2個主要限制因素是試劑的高成本和不能自動完成操作。如果可以降低每反應的總體積，使DNA聚合酶和核苷酸也同時減少，就可降低試劑成本。用自動控制的針附件排列小量試劑的準確可靠方法可有助于解決這兩個PCR問題。
如上所述，移液裝置已在微生物學和分子生物學領域中使用了一段時間。已經使用的這類裝置大致可分為2個類別。由正/負壓驅動的壓力裝置(例如泵和自動移液器)，其通過移液頭將固定的等分液體樣品移到固體表面或微量滴定板加樣孔中。已經建立對應于標準96孔微量滴定板形式的移液器陣列(Reek等，生物技術19282，1995)。這些裝置在5μl及以上體積范圍最準確，但是一般不太適于更小體積的任務。
固體表面針式裝置依賴于針表面積和調節液體表面張力的因素而轉移液體，并且由于其簡便性和轉移小量液體的能力而得到廣泛應用。數年來已在自動裝置中使用這些固定針式裝置以印跡核酸微點陣列的多個拷貝，然后將其用于雜交反應以測定基因表達。
研究人員已修飾了傳統的固定微陣列印跡頭，使它含有微管道，微管道通過毛細作用發揮功能從而收集和容納用于隨后印跡到玻璃表面上的液體(Schena等，科學270467，1995；Schena，BioEssays 18427，1996；Shalon等，基因組研究.6639，1996)。這樣的印跡頭已通過自動系統用于將PCR擴增的cDNA插入片段印跡到微陣列中。使用此系統進行小體積(每微點2μl)雜交反應以借助同時發生的雙色熒光雜交測定45個基因的差異表達(Schena等，科學270467，1995)。
在本領域需要高效、價格合理的方法以將寡核苷酸和其它生物分子排列到平坦的固體支持物上。本發明提供在此詳細公開的這些及相關的優點。
發明概述在一方面，本發明提供一種彈性探頭，包括包住壓縮彈簧的管狀套殼，所述彈簧與活塞機械連接，所述活塞具有伸出所述套殼的第一個區域，所述第一個區域包括以平坦表面終止的錐形端部，所述表面與所述套殼的縱軸垂直，所述錐形端部在其剖面具有與上述表面相鄰接的外側邊，如果上述外側邊越過上述表面延伸，則相交于距上述表面約0.001-0.005英寸處的點。
在另一方面，本發明提供一種組合物，包含基于組合物總體積約35體積％至80體積％濃度的增稠劑、0.001μg/mL到10μg/mL濃度的寡核苷酸以及水。
在另一方面，本發明提供一種將生物分子點樣到固體支持物上的方法。此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉移到所述固體支持物上。
用于點樣的彈性探頭包括上述包住壓縮彈簧的管狀套殼。
在另一方面，本發明提供一種排列生物分子的方法。此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉移到所述固體支持物上。
重復接觸步驟多次以使生物分子以陣列形式排列于固體支持物上。而且，帶有管狀套殼的彈性探頭如上所述。
參照附圖和下面詳細的描述，本發明的其它方面將變得顯而易見。
附圖描述

圖1A是根據本發明實施方案所述的陣列的俯視平面示意圖。
圖1B是圖1A的陣列的剖面示意圖。
圖2A是用于制備本發明陣列的移液裝置的等軸視圖。
圖2B是根據本發明所述的移液頭的實施方案的放大正面立視圖。
圖3是帶有錐形設計的另一種移液頭的正面立視圖。
圖4A是根據本發明另一實施方案所述的帶有凹槽、錐形設計的移液頭的另一實施方案的正面立視圖。
圖4B是圖4A的移液頭的仰視平面圖。
圖5表示根據本發明制備并用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame，California)顯色且用CCD相機和顯微鏡拍攝的微點陣列。
圖6表示同時存在于單一陣列單元中的兩種不同寡核苷酸如何根據本發明得到鑒定和部分定量測定。
圖7表示用本發明方法學由機器人制備的陣列的CCD相機圖像，其中點區域直徑約100-150微米，相鄰點與點之間中心到中心的間距為200微米。直徑的標準偏差是約15％。
圖8是用熒光濾鏡在熒光下攝制的顯微照片，顯示從分析溶液轉移的非媒介物成分(在此情況下是熒光微球體)的可重復點樣(通過肉眼觀察測定)。
發明詳述本發明提供一種使用特殊設計的移液裝置和/或特殊制備的生物分子溶液和/或特殊涂敷的固體支持物將生物分子以高度可控制方式點樣到固體支持物上的方法。更具體地，本發明提供了一種將生物分子點樣到固體支持物上的方法，其中方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉移到所述固體支持物上。
自從在印刷電路板工業發展的初期被引進以來，彈性探頭已變得眾所周知。它們是設計用于在裝配功能電路板時滿足準確可靠構建和測試各種電子元件及其連接要求的機械裝置。彈性探頭基本上是電子機械裝置，由包住壓縮彈簧、球體和活塞的管狀套殼組成。有些探針是特殊設計以攜帶電流，而其它一些用于鉆孔、彎曲和將元件固定到電路板上，還有一些設計用于進行焊接。設計或銷售彈性探頭方面，還沒證明它們作為用于將溶液轉移和排列到固體支持物上以在微生物學、生物化學或分子生物學領域使用的機械裝置的潛在用途。改進的彈性探頭彈性探頭可從數家供應商得到，包括Evertt Charles(Pomona CA)，Interconnect Devices Inc.(Kansas City，Kansas)和Test ConnectionsInc.，(Upland，CA)。
圖2A是表示用于選擇性地將分離的、可控量生物分子溶液轉移到陣列10的PEI層30上的優選裝置和方法的等軸視圖。在一種實施方案中，裝置帶有與致動器60可操作連接的彈性探頭50和與彈性探頭50相反端連接的移液頭70。彈性探頭50一般包括包住偏置部件54的套殼52和活塞56，活塞有與偏置部件54相鄰接的第一端57和從套殼52中伸出的第二端58。套殼52可以是管狀筒而偏置部件54可以是將活塞56的第二端58從套殼52推出的壓縮彈簧。活塞56的第一端57因此帶有與從套殼52向內放射狀伸出的止動物59咬合的凸肩57a從而限制活塞56相對于套殼52的最大延伸量。適當的彈性探頭50可從Evertt Charles(Pomona，California)，Interconnect Devices Inc.(Kansas City，Kansas)、TestConnections，Inc.，(Upland，California)以及其它制造商得到。
致動器60優選地沿著與陣列10垂直的軸線(箭頭V所示)并在與PEI層30表面平行的平面(箭頭P所示)移動彈性探頭50。因此，致動器60控制彈性探頭50從而將移液頭70浸入含有生物分子流體90的容器80中，將彈性探頭50定位到PEI層30的所需位點上，并且將移液頭70壓至PEI層30的所需位點上。在另一實施方案中，致動器60可能僅僅與至陣列10垂直地移動彈性探頭50，而另一致動器(未顯示)移動陣列10和容器80以將移液頭70定位至容器80或PEI層30的所需位點。致動器60優選地是自動將生物分子溶液移至PEI層30上的機器人或其它計算機控制的操作裝置。此外，可將多個彈性探頭50與一個致動器連接以同時將多個生物分子物質移至PEI層30上。
移液頭70優選地吸取足夠量的生物分子流體90至其表面上以將多個的生物分子物質移至PEI層30上并形成相應的多個點樣區域32(圖1A中所示)。圖2B是根據本發明一個實施方案所述的移液頭70的放大正面立視圖。移液頭70優選地具有截短的圓錐形狀，帶有端面72和多個凹槽或溝道74。端面72可以是從假想的交點73凹進的平面，凹進的距離“R”約在0.00001英寸和0.010英寸之間。并且更優選地約在0.001英寸和0.005英寸之間。此外，凹槽74具有以約15°到120°、并且更優選地以約60°到90°的角α向端面72聚集的翼或脊76。
彈性探頭50、致動器60和移液頭70一起運行從而在每次致動器60將移液頭70壓至PEI層30上時，將可控量的生物分子流體移至PEI層30上。致動器60開始將移液頭70浸入生物分子流體90的容器80中以通過毛細作用汲取和容納較大體積的生物分子流體92(圖2B)到移液頭70上。然后致動器60將彈性探頭50定位至PEI層30上。在容器80中取出移液頭70后，一部分移液頭70上的生物分子流體92在移液頭的端面72形成懸掛物94。然后致動器將移液頭70壓至PEI層上以從移液頭70上的生物分子流體部分形成陣列10的單個分開離的點樣區域32(圖1A和1B中所示)。致動器60優選地將移液頭70壓至PEI層30上以使移液頭70以指定量的壓力接觸PEI層30。然而，用相同壓力將移液頭70連續壓至PEI層30上是困難的，因為致動器60不能總是以相同高度定位移液頭70并且PEI層70表面可能不一樣平。偏置部件54因此儲存把移液頭70壓到PEI層30上產生的能量，從而允許彈性探頭50在每次移液時以基本上恒定的壓力接觸PEI層30而不論致動器60的行程或PEI層30表面狀態的微小不規則性。
因此上述移液系統提供在每次移液頭70與PEI層30接觸時可移送恒定點樣體積的生物分子流體的裝置。應當理解應將精確、恒定體積的生物分子流體移至每個點樣區域的PEI層30上以在PEI層30中維持間隔區34。點樣至點樣區域32上的PEI層30中的生物分子流體的量一般憑經驗確定，并且它是移液頭70與PEI層30接觸的時間、生物分子流體90的粘度、移液頭70的構造以及移液頭70與PEI層30之間的壓力的函數。因為偏置部件54在移液頭70與PEI層30之間提供了基本上恒定的壓力，所以影響移至PEI層30的生物分子流體量的首要因素是移液頭70與PEI層30之間接觸的時間。
圖3是根據本發明所述的移液頭170的另一個實施方案的正面立視圖。在此實施方案中，移液頭170具有無凹槽或翼片的截短的錐形狀。因此，移液頭170在其錐形部分的表面容納生物分子流體。雖然移液頭170可用于將生物分子流體移到PEI層30上，但是一般地使用帶凹槽的移液頭是更理想的，因為這樣的移液頭容納更多的生物分子流體。
圖4A是帶有多個凹槽274和翼片276的移液頭270的另一實施方案的正面立視圖，圖4B是其仰視平面圖。移液頭270基本上以與上述移液頭70相同的方式操作，并且因此也提供基本上相同的優點。
上述的移液頭70、170和270代表一些可用于將生物分子流體點樣到PEI層30上的移液頭實例。應當理解可對這些移液頭進行多種改進，包括使用不同形狀的端面設計。例如，根據具體應用，這些移液頭可以具有角錐形、圓柱形、立方形或其它適當形狀。此外，這些凹槽可以具有除了本發明附圖中所示的構造之外的其它構造。因此，移液頭不一定局限于圖2B-4B中說明的那些種類。生物分子溶液本發明提供可用于將生物分子點樣到平坦表面上的組合物。這些組合物特別適于用上述改進的彈性探頭轉移到平坦表面上。當本發明的組合物與改進的彈性探頭一起使用時，在僅一次汲取液體后可重復將多個微滴(例如10以上并且優選地100個以上微滴)點樣到平坦表面上。
本發明提供一種也稱為“布列溶液”的組合物，包含基于組合物總體積約35體積％到約80體積％濃度的增稠劑、生物分子(優選地是0.001μg/mL到10μg/mL濃度范圍的寡核苷酸)和水。令人吃驚地發現在水性寡核苷酸組合物中含有增稠劑時，增稠劑賦予組合物所需的流變學特性，因此使組合物能與此處公開的改進的彈性探頭一起使用，在僅一次從組合物池汲取組合物的情況下將多個均勻的微滴移至有PEI涂層的平坦表面上。
對于液體增稠劑如甘油，濃度為35％V/V到80％V/V。組合物中優選的增稠劑濃度在一定程度上取決于進行排列時的溫度。排列溫度越低，需要使用的增稠劑濃度越低。溫度和粘度控制的組合使得可以在大多數固體支持物(例如玻璃、硅片、尼龍6/6、尼龍膜等)上進行排列。
增稠劑的存在還有其它好處，即允許各種其它低濃度物質與生物分子同時存在。例如，0.001％V/V到1％V/V的去污劑可存在于布列溶液中。這是有用的，因為PCR緩沖液含有少量的Tween-20或NP-40，并且直接從PCR排列核酸樣品而無須事先純化擴增子通常是有利的。使用增稠劑允許在布列溶液中含有鹽(例如NaCl，KCl或MgCl2)、緩沖液(例如Tris)和/或螯合劑(例如EDTA)。使用增稠劑還有其它好處，即允許交聯劑和/或有機溶劑存在于布列溶液中。正如商業上得到的，交聯劑通常溶解于有機溶劑如DMSO、DMF、NMP、甲醇、乙醇等溶劑中。當使用增稠劑時，常用的有機溶劑可以0.05％到20％(V/V)的水平用于本發明的布列溶液中。
一般來說，增稠劑賦予布列溶液增加的粘度。當布列溶液中達到適當粘度時，點樣的第一滴基本上與例如第100滴大小相同。當布列溶液中使用不適當粘度時，點樣的頭幾滴顯著大于后來點樣的液滴。所需的粘度在純水與純甘油的粘度之間。
本發明的布列溶液可用于將微滴點樣到幾乎任何表面上。因為固體支持物的表面特性對微滴的點樣幾乎沒有影響或沒有影響，所以生物樣品可排列到幾乎任何類型的有涂層表面或有聚合物涂層的固體支持物上。例如，一般的水溶液在用親水性聚合物如聚賴氨酸或聚乙烯亞胺涂敷的固體支持物上傾向于迅速擴散而這些相同溶液不容易點樣在疏水性表面如硅片上。然而，含有根據本發明所述的增稠劑的布列溶液可用于將均勻的微滴點樣于任何這些基質上。
在排列過程中包括增稠劑如甘油的另一重要好處是質量控制。例如當將甘油用于本文所述的排列方法時，將一小滴液體點樣于固體支持物上。以此處所述的方法中常用的濃度時，此甘油濃度足以防止微滴的蒸發。因此，在化學處理陣列之前可檢查每個排列針頭的每個印跡。觀察微滴的能力實質上增強了對排列過程進行質量控制的能力。這導致排列方法學價值的重要增加。
生物分子可以是核酸多聚物或其類似物如PNA、硫代磷酸酯和膦酸甲酯。核酸指核糖核酸和脫氧核糖核酸。生物分子可包括非天然和/或合成的堿基。生物分子可以是單鏈或雙鏈核酸多聚物。
優選的生物分子是包括寡核苷酸(多達約100個核苷酸堿基)和多核苷酸(超過約100個堿基)的核酸多聚物。優選的核酸多聚物由15到50個核苷酸堿基形成。另一優選的核酸多聚物有50到1,000個核苷酸堿基。核酸多聚物可以是PCR產物、PCR引物或核酸雙鏈，在此列出幾個實施例。然而，如下文所述，當核酸含有伯胺時，基本上所有核酸類型可與PEI涂敷的表面共價結合。布列溶液中核酸多聚物的一般濃度為0.001-10μg/mL、優選地0.01-1μg/mL、更優選地0.05-0.5μg/mL。
優選的核酸多聚物為“胺修飾的”，因為它們經修飾在核酸多聚物的5’末端含有伯胺基，優選地在核酸多聚物的伯胺與核酸部分之間有一個或多個亞甲基。6是亞甲基的優選數目。胺修飾的核酸多聚物是優選的，因為它們可通過5’-胺基與固體支持物共價連接。可使用5’-己胺修飾的PCR引物排列PCR產物。可在使用胺烯丙基-dUTP(Sigma，St.Louis，MO)通過切口移位導入胺之后排列核酸雙鏈。用氨基烯丙基-dUTP通過聚合酶如末端轉移酶或用連接酶通過將含胺的短核酸多聚物連接到核酸上可將胺導入核酸中。
優選地，在與PEI涂層接觸之前活化核酸多聚物。通過使胺功能化的核酸多聚物與多功能胺-反應性化學物如三氯三嗪(Trichlorotriazine)混合可方便地實現這一點。當核酸多聚物含有5’-胺基時，5’-胺可與也稱為氰尿酰氯的三氯三嗪反應(Van Ness等，核酸研究.19(2)3345-3350，1991)。優選地，將過量的氰尿酰氯加入核酸多聚物溶液中，其中超過布列溶液中核酸多聚物胺數10-到100-倍摩爾數過量的氰尿酰氯是優選的。在此方法中，大多數以胺終止的核酸多聚物與一分子三氯三嗪反應，因此核酸多聚物變成以二氯三嗪終止。
本發明的有利特征是含有生物分子的布列溶液即使含有大量的三氯三嗪也可點樣到PEI涂層上。這提供了優于在進行排列之前需要從布列溶液去除偶聯劑的方法的顯著優勢。
當核酸多聚物是雙鏈時，本發明優選的實施方案提供兩條鏈或其中一條鏈含有末端氨基。雙鏈核酸多聚物可通過一個末端氨基結合到PEI涂層上，由此固定此雙鏈多聚物。然而，因為兩條鏈中僅有一條鏈與PEI涂層共價結合，所以另一鏈可在變性和洗滌條件下去除。此方法提供根據本發明實施單鏈核酸多聚物的排列的一種方便方法。雙鏈核酸多聚物可例如作為PCR反應產物得到。
優選地，用常用緩沖液如磷酸鈉、硼酸鈉、碳酸鈉或Tris HCl緩沖布列溶液。布列溶液的優選pH范圍是7到9，其中優選的緩沖液是新鮮制備的pH8.3到pH8.5的硼酸鈉溶液。
為了制備一般的布列溶液，將己胺修飾的核酸多聚物以0.1μg/ml置于0.2M硼酸鈉pH8.3中至50μl總體積。然后加入10μl 15mg/mL的氰尿酰氯溶液，并且讓反應于25℃持續攪拌下進行1小時。加入甘油(GibcoBrl，Grand Island，NY)至56％終濃度。固體支持物本發明提供一種將生物分子點樣固體支持物上的方法，此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉移到所述固體支持物上。固體支持物優選地具有點樣生物分子的平坦表面。
用于此目的的固體支持物實例是一般用于電子工業中構建半導體的硅片。這些硅片在一側是高度磨光和反光的并且可容易地使用硅烷化學法用聚乙烯亞胺涂敷。這些硅片在商業上可從諸如WaferNet(San Jose，CA)的公司得到。用聚合物如聚乙烯亞胺對硅片和玻片的涂敷可通過公司如Cel Associates(Houston，Texas)在合同下進行。具有反光性涂層的玻片也可容易地使用硅烷化學法用聚乙烯亞胺涂敷。
聚乙烯亞胺多聚物涂層允許使用商業上可得到的交聯劑(Pierce，Rockford，IL)將寡核苷酸、PCR片段或擴增子、DNA分子或片段或其它含有胺基的生物分子共價結合到固體支持物上。聚乙烯亞胺(PEI)涂敷的載片也具有長保存期穩定性的額外好處。
另一理想的固體支持物是金屬如不銹鋼。這樣的金屬固體支持物可用作MALDI-TOF分析中的基質，其中待通過MALDI-TOF分析的成分用此處公開的印跡方法點樣。排列條件和排列后的處理如上所述的布列溶液可直接用于排列過程。也就是說，在排列核酸多聚物的優選實施方案中，在印跡步驟前沒有從未反應的氰尿酰氯中純化活化的核酸多聚物。令人驚奇地發現在排列方法的印跡步驟前不必去除過量的交聯劑。也就是說，在反應混合物中過量的氰尿酰氯不影響或競爭核酸多聚物與有PEI涂層的固體支持物的共價結合。這是因為固體支持物上的胺多于將以任何給定體積(納升到皮升)排列的氰尿酰氯分子的數目。
一般讓活化核酸結合到固體支持物上的反應在20到50℃進行1到20小時。優選地，反應時間是于25℃1小時。
本發明的陣列在進行雜交分析中特別有用。然而，為了進行這種分析，在進行雜交步驟前必須對固體支持物上的胺加帽。這可通過使固體支持物與0.1-2.0M琥珀酸酐反應來實現。優選的反應條件是70％m-pyrol和0.1M硼酸鈉中的1.0M琥珀酸酐。一般使反應進行15分鐘到4小時，其中優選的反應時間是于25℃30分鐘。殘余的琥珀酸酐用3X水洗加以去除。
然后將固體支持物與在pH7-9的0.1-10.0M硼酸鈉中含有0.1-5M甘油的溶液一起溫育。該步驟對任何可以共價結合到PEI表面上的二氯三嗪“加帽”。優選的條件是在pH8.3的0.1M硼酸鈉中的0.2M甘油。
然后可以用含有去污劑的溶液洗固體支持物以去除未結合的物質，例如微量的m-pyrol。
優選地，將固體支持物在0.01M NaCl、0.05M EDTA和0.1M Tris(pH8.0)中加熱至95℃5分鐘。此加熱步驟去除未共價結合的核酸多聚物如PCR產物。在排列雙鏈核酸的情況中，此步驟也具有將雙鏈變成單鏈形式(變性)的效應。
排列可通過生物素化的探針(例如寡核苷酸、核酸片段、PCR產物等)加以檢測。使核酸生物素化的方法在本領域眾所周知并且由Pierce進行了充分描述(抗生物素蛋白-生物素化學手冊，Pierce化學公司，1992，Rockford Illinois)。探針一般以0.1ng/mL到10μg/ML在包括GuSCN、GuHCl、甲醛等的標準雜交液中使用(參見Van Ness和Chen，核酸研究195143-5151，1991)。
為檢測雜交事件(即生物素的存在)，將固體支持物與鏈霉抗生物素蛋白/辣根過氧化物酶偶聯物一起溫育。這樣的酶偶聯物在商業上可獲自例如Vector Laboratories(Burlingham，CA)。鏈霉抗生物素蛋白以高親和性結合生物素分子從而使辣根過氧化物酶與雜交探針靠近。未結合的鏈霉抗生物素蛋白/辣根過氧化物酶偶聯物用簡單洗滌步驟洗去。然后在過氧化物和適當緩沖液存在的情況下利用沉淀底物檢測過氧化物酶的存在。
對于比色分析基質，點樣于反光性表面如硅片上的藍色酶產物具有與預期相比低許多倍水平的檢測(LLD)。此外，LLD對于不同的有色酶產物有很大不同。如實施例5中所示，每50μM直徑點4-甲氧基-napthol(產生沉淀的藍色產物)的LLD是約1000個分子，而紅色沉淀的物質每50μM直徑點給出約1000倍更高1,000,000個分子的LLD。通過用裝有可見光源和CCD相機(Princeton Instruments，Princeton，NJ)的顯微鏡(如可從Zeiss商業上得到的Axiotech顯微鏡)檢測表面來測定LLD。一次可掃描約10,000μM×10,000μM的圖象。
為了用藍色比色測定方案，表面在酶反應后必須很干凈并且硅片或載片必須在干燥狀態下掃描。此外，酸反應必須在對照點飽和之前終止。對于辣根過氧化物酶，這大約是2-5分鐘。
也可以使用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶(HRP)的化學發光底物或HPP或堿性磷酸酶的熒光底物。實例包括可獲自Perkin Elmer的堿性磷酸酶diox底物或可獲自JBL Scientific(Scan Luis Obispo，CA)的AttophosHRP底物。生物分子溶液的自動轉移本發明提供一種將生物分子點樣到固體支持物上的方法，此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉移到所述固體支持物上。在優選實施方案中，接觸步驟自動進行，換句話說，是可在x，y和z軸上加以控制的精密自動系統。精密Cartesian自動系統將由與適當馬達、放大器、移動控制器、個人計算機和軟件連接以驅動工作臺的精密線性定位工作臺組成。精密線性定位工作臺可獲自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本東京)。馬達、放大器和移動控制器可獲自Parker Hannifin公司(DaedelDivision，Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司(Mountain View，CA)。軟件將最可能是自定義的并且可用語言如BorlandC++4.5(Borland International Inc.，Scotts Valley，CA)或VisualBasic 4.0(微軟公司，Redmond，WA)編寫。個人計算機可獲自眾多生產商如Dell計算機公司(Austin，TX)。
如上所述的彈性探頭制備成裝在任何類型的接受器中，本發明中有用的機器人含有適當大小的接受器以容納彈性探頭。優選的接受器由鎳-銀或青銅制成，然后在堅硬的鎳上鍍金。優選的接受器設計是直徑0.5mm到2.0mm、更優選地1.68毫米的金屬管。將0.5mm到1mm厚、更優選地0.64mm厚的方線彎入金屬管的一端并封閉。每個套殼制備有凹痕和壓環以安全地容納彈性探頭。將探頭插入接受器中，因此探頭管與接受器末端平齊。
為了排列液體的目的，將安裝頭部安裝到機器人上。該頭部具有可在不同印跡應用時拆卸的扣栓。例如，通過取下2個螺絲并用一個設計以容納從384孔板點樣的彈性探頭的扣栓代替一個設計以容納從96孔板點樣的彈性探頭的扣栓可容易地改變扣栓。用精密鉆出的、雙水平的孔與接受器的繞線和彎曲區域適當匹配借助摩擦力將接受器固定在扣栓上。這種設計使得可以容易地更換損傷或操作不靈的接受器和/或彈性探頭。一旦插入，接受器/彈性探頭組件從扣栓向下伸出25mm，從而允許探針到達裝有待排列樣品液的微量滴定板底部。
印跡方法和溶液以及將生物分子點樣的方法可用于制備陣列。這些陣列可用于各種分析，其中那些分析可包括作為探針的標記生物分子(例如標記的寡核苷酸)。標記的生物分子的實例和使用其的分析法描述于美國專利申請Nos.08/786,835；08/786,834和08/787,521(各于1997年1月22日提交)，以及具有申請Nos.08/898,180；08/898,564和08/898,501的三個美國部分繼續專利申請(各于1997年7月22日提交)，以及PCT國際公開Nos.97/27331；97/27325和97/27327中。在此完全引用這6個美國專利申請和3個PCT國際公開的全文作為參考。
此外，本發明的裝置和方法可用于制備在單元中含有一個以上寡核苷酸序列的陣列。在成分中含有一個以上寡核苷酸序列的生物分子陣列及其使用描述于1997年7月22日提交的題為“排列單元內的多功能性及其用途”的美國臨時專利申請No.60/053,436和與其同時提交的類似題目的美國非臨時專利申請No.＿＿中，在此完全引用二者的全文作為參考。
本發明的裝置和方法也可用于制備在進行擴增和其它酶反應中有用的陣列，如在我們1997年7月22日提交的題為“對核酸陣列進行的擴增和其它酶反應”的美國臨時專利申請No.60/053,428和與其同時提交的類似題目的美國非臨時專利申請No.＿＿中所述，在此完全引用二者的全文作為參考。
本發明的裝置和方法可用于制備生物分子陣列，如于1997年7月22日提交的題為“基于聚乙烯亞胺的生物分子陣列”的美國臨時專利申請No.60/053,352和與其同時提交的類似題目的美國非臨時專利申請No.＿＿中所述，在此完全引用二者的全文作為參考。
如1997年7月22日提交的題為“使數據相關的計算機方法和系統”的美國臨時專利申請No.60/053,429和與其同時提交的類似題目的美國非臨時專利申請No.＿＿(在此充分引用二者的全文作為參考)中所述的使數據相關的計算機系統和方法、更具體地使標記的數據與和標記數據有關的信息相關的計算機系統和方法可與本文公開的方法和裝置結合使用。
對于許多生物技術應用，本發明有很大的用途，特別是那些涉及利用聚合酶鏈式反應(PCR)，核酸雜交，通過雜交的核酸測序，病毒、細菌或細胞文庫的復制開發大規模診斷篩選方法的方法以及任何其它涉及反復將溶液排列到固體表面上的方法。
提供以下實施例作為舉例說明而不是限制。實施例實施例1一步法制備有PEI涂層的玻片用0.1N乙酸洗玻片，然后用水沖洗直到從玻片上洗出的水的pH與用于沖洗玻片的水的pH相同。然后使玻片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足夠量的溶于2-丙醇(Gelest，Inc.，Tullytown，PA，目錄號SSP060)中的50％w/w三甲氧基甲硅烷基丙基-聚乙烯亞胺(600MW)以達到2％w/w終濃度。攪拌此2％溶液5分鐘后，將玻片浸入溶液中，輕輕攪拌2分鐘，然后取出。為了洗去過多的甲硅烷基化試劑，將玻片浸入乙醇中。然后使玻片空氣干燥。實施例2一步法制備有PEI涂層的硅片用0.1N乙酸洗硅片(WaferNet，San Jose，CA)，然后用水沖洗直到從硅片上洗出的水的pH與用于沖洗硅片的水的pH相同。然后使硅片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足夠量的溶于2-丙醇(Gelest，Inc.，Tullytown，PA，目錄號SSP060)中的50％w/w三甲氧基甲硅烷基丙基-聚乙烯亞胺(600MW)以達到2％w/w終濃度。攪拌此2％溶液5分鐘后，將硅片浸入溶液中，輕輕攪拌2分鐘，然后取出。為了洗去過多的甲硅烷基化試劑，將硅片浸入乙醇中。然后使硅片空氣干燥。實施例3一步法制備有PEI涂層的玻片用0.1N乙酸洗玻片，然后用水沖洗直到從玻片上洗出的水的pH與用于沖洗玻片的水的pH相同。然后使玻片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足夠量的親電子甲硅烷基化試劑，同時攪拌以達到2％w/w終濃度。親電子甲硅烷基化試劑是2-(3，4-環氧環己基)乙基三甲氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4670.0)，3，4-環氧丁基三甲氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4665.0)或3-異氰酸根丙基三乙氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SII6454.0)之一。攪拌此2％溶液5分鐘后，將玻片浸入溶液中，輕輕攪拌2分鐘，然后取出。為了洗去過多的甲硅烷基化試劑，將玻片浸入乙醇中。
通過用1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)稀釋30％聚乙烯亞胺(Polysciences，Warrington，PA)水溶液來制備70,000分子量聚乙烯亞胺的3％(w/v)溶液。將處理的玻片浸入3％溶液中并輕輕攪拌24小時。為了去除玻片上過多的PEI，將玻片浸入NMP中(2X)，然后浸入同時含有0.09M NaCl、50mM TrispH 7.6和25mM DETA的0.1％十二烷基磺酸鈉水溶液中(2X)，然后浸入水中(2X)，并且最后浸入乙醇中(1X)。然后使玻片空氣干燥。實施例4一步法制備有PEI涂層的硅片按照實施例3中所述用0.1N乙酸洗硅片(WaferNet，San Jose，CA)，然后也按照實施例3中所述用甲硅烷基化試劑和PEI處理。實施例5從商業彈性探頭制備點樣頭XP54P彈性探頭購自Osby-Barton〔Everett Charles(Pomona，CA)的分公司〕。將探頭“端部向下”對著超細的金剛磨石(DMT Inc.，Miami Lattes，FL)并以輕輕的壓力在磨石上橫移約0.5cm距離。通過顯微鏡觀察到由此從點樣頭的末端去掉約0.005英寸(0.001到0.01英寸)的金屬。然后通過在皮帶上摩擦端部將點樣頭末端磨光。然后用水洗端部。在開始使用前或使用之間，將點樣頭干燥保存或于-20℃保存在50％甘油中。實施例6用改進的彈性探頭裝配排列裝置將實施例5中制備的端部安裝到布列頭部中，布列頭部裝在可在x，y和z軸上控制的精密自動系統上。精密Cartesian自動系統將由與適當馬達、放大器、移動控制器、個人計算機和軟件連接以驅動工作臺的線性定位工作臺組成。精密線性定位工作臺可獲自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本東京)。馬達、放大器和移動控制器可獲自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司(Mountain View，CA)。實施例7用親水性表面促進液體汲取、液體轉移和微滴點樣按照實施例5將彈性探頭端部浸于100mM 1，4-二硫蘇糖醇和0.1M的硼酸鈉溶液中60分鐘。二硫蘇糖醇將通過硫醇-金配位與金表面反應以制備金親水性表面(表面基本上羥化)。實施例8反應性寡核苷酸的制備將75μl 5’-己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’(0.5μg/μl)溶液與5μl 20mg/ml的氰尿酰氯和20μl 1M的硼酸鈉在室溫反應30分鐘。實施例9寡核苷酸的布列溶液制備由12.5μL pH8.3的1M硼酸鈉(新鮮制備或從-20℃儲液凍融)、50μl 0.1μg/μL的5’己胺寡核苷酸(5’己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’)、7.5μL乙腈中的15mg/mL氰尿酰氯組成的布列溶液。將此混合物在室溫下溫育30到60分鐘。然后向溶液加入155μL 80％甘油并將所得溶液充分混合。在某些情況下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％的Tween 20或10％的Triton X-100(Rohm和Hass，費城)。當排列基質由尼龍或硝酸纖維素膜組成時，向布列溶液加入25μL 5M的NaCl。實施例10 PCR擴增子的布列溶液當排列PCR擴增子時，在完成熱循環步驟后將2.5μL pH8.3的1M硼酸鈉(新鮮制備或從-20℃儲液凍融)、50μl 0.1μg/μL的5’己胺寡核苷酸(5’己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’)、7.5μL乙腈中的15mg/mL氰尿酰氯加入含有PCR內容物的PCR管中。將此混合物在室溫下溫育30到60分鐘。然后向溶液加入155μL 80％甘油并將得到的溶液充分混合。在某些情況下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％的Tween 20或10％的Triton X-100。當排列基質由尼龍或硝酸纖維素膜組成時，向布列溶液加入25μL 5M的NaCl。實施例11排列寡核苷酸的制備按照實施例6將實施例5的改進的彈性探頭安裝在自動移液裝置中，并且按照實施例7處理彈性探頭端部。將端部浸入實施例9的布列溶液中5毫米2秒種。然后機器人用帶有溶液的端部以12×6網格在有聚乙烯亞胺(PEI)涂層的硅片上印跡72個微點，硅片根據實施例2、4中的任一項制備或由將會根據合同制備有PEI涂層的基質的Cell Associates(Houston，Texas)等提供。產生的點直徑約100-150微米，相鄰點之間中心到中心的間距是200微米。實施例12活性PEI位點的封閉為了封閉排列上未反應的PEI位點，用100mg/mL 100％ NMP中的琥珀酸酐處理實施例11的陣列15分鐘。實施例13未反應的氰尿酰氯位點的封閉為了封閉排列上未反應的氰尿酰氯位點，用0.1M 0.01M Tris中的甘油處理實施例12的陣列15分鐘，然后用Tens(0.1M NaCl，0.1％SDS，0.01MTris，5mM EDTA)洗4次。實施例14雜交方法使實施例13的陣列中的固定寡核苷酸與其生物素化的互補產物(5’-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’)在37℃雜交20分鐘，用6XTens、2XOHS
洗。
雜交后，將硅片浸入0.5μg/ml堿性磷酸酶鏈霉抗生物素蛋白中15分鐘，用2XTens、4XTWS(0.1M NaCl，0.1％Tween20，0.05M Tris)洗。然后用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame，Califor-nia)(按照試劑盒方法)使微點顯色并用CCD相機和顯微鏡照相。圖5顯示產生的圖象。實施例15單一陣列單元內的多個寡核苷酸濃度均為0.5μg/μl的2種模板寡核苷酸(寡核苷酸#1＝5’己胺-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’，寡核苷酸#2＝5’己胺-ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)分別與20μl 1M硼酸鈉中的5μl 20mg/ml氰尿酰氯于室溫反應30分鐘(總反應體積＝100μl)。從這兩個反應制備由56％甘油和這兩種寡核苷酸的稀釋組合組成的布列溶液(見表1)。將8個點樣頭各浸入8種布列溶液中5毫米2秒鐘。然后機器人在聚乙烯亞胺(PEI)涂敷的硅片上用帶有溶液的端部印跡2套8個各含有72個微點的12×6網格。每個網格代表單一的布列溶液。產生的點直徑約100-150微米，相鄰點之間中心到中心的間距是200微米。
排列后，硅片上未反應的PEI位點用100mg/mL 100％N-甲基吡咯烷酮中的琥珀酸酐封閉15分鐘，水洗3X。未反應的氰尿酰氯位點用0.01M Tris中的0.1M甘油封閉15分鐘，Tens(0.1M NaCl，0.1％SDS，0.01M Tris，5mM EDTA)洗4X。然后進行兩種雜交。
在第一種雜交中，將一套8種排列的寡核苷酸組合與互補于寡核苷酸#1的生物素化寡核苷酸(5’-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’)雜交。在第二種雜交中，將另一套8種排列的寡核苷酸組合與互補于寡核苷酸#2的生物素化寡核苷酸(5’-生物素-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCGCGCCTGATCAGTAGT-3’)雜交。雜交于37℃在Hybriwell SealingCovers(Research Products Internat ional Corporation，Mount Prospect，Illinois)下同時進行20分鐘，用6XTens、2X CHS(0.06M Tris，2mMEDTA)、5XDenhardt’s溶液、6XSSC(3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)、3.68mM N-月桂酰肌氨酸、0.005％NP-40洗。
雜交后，將硅片浸入0.5μg/ml辣根過氧化物酶鏈霉抗生物素蛋白中15分鐘，用2XTens、4XTWS(0.1M NaCl，0.1％Tween 20，0.05M Tris)洗。然后用0.4mg/ml的4-甲氧基-1-napthol(0.02％過氧化氫，12％甲醇，PBS)使微點顯色，最后水洗3X。
與寡核苷酸#1的互補產物雜交的混合寡核苷酸系列對于含有最高濃度寡核苷酸#1的網格表現最強的顏色強度而對于含有最低濃度寡核苷酸#1的網格表現最低的顏色強度。而且，與寡核苷酸#2的互補產物雜交的混合寡核苷酸系列對于含有最高濃度寡核苷酸#2的網格表現最強的顏色強度而對于含有最低濃度寡核苷酸#2的網格表現最低的顏色強度(見圖6)。
表1<

>實施例16測定單元大小的一致性制備由56％甘油和44％用藍色食物染料染色的水組成的布列溶液。將點樣頭浸入布列溶液中5毫米2秒鐘。然后機器人用帶有甘油的端部以12×6網格在硅片上印跡72個微點。產生的點直徑約100-150微米，相鄰點之間中心到中心的間距是200微米。圖7顯示機器人產生的網格的CCD相機相片。點直徑的標準偏差約為15％。實施例17測定排列方法內的可重復性制備由56％甘油、0.01M Tris pH 7.2、5mm EDTA、0.01％肌氨酰和1％V/V Fluoresbrite Plain 0.5μM微球體(2.5％Solids-latex)(Polysciences，Warrington，PA)組成的布列溶液。將點樣針頭浸入溶液中5毫米5秒鐘并且然后用于在玻片上印跡多個微點。然后用熒光濾鏡在熒光下進行顯微攝影。圖8顯示每個微點(陣列單元)熒光微球體的高度重復性點樣(通過肉眼觀察測定)。實施例18測定每單元核酸多聚物的濃度將與點樣的寡核苷酸互補的寡核苷酸(5’-德克薩斯紅-CAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGAC)與3M硫氰酸胍(GcSCN)、0.01M TrispH 7.5、5mM EDTA和0.1％肌氨酰中的陣列雜交。體積足以覆蓋固體支持物〔對于玻片(1×3英寸)為1mL〕。德克薩斯紅寡核苷酸的濃度為5μg/ml，并且反應在室溫進行。使雜交進行30分鐘。然后用Tens洗玻片(5X)。然后用1mL洗脫緩沖液(0.005M Tris pH7.6，0.0005M EDTA，0.01％肌氨酰)覆蓋玻片并加熱到95℃2分鐘。從玻片上汲取溶液并將其置于黑色微量滴定板中。在黑色微量滴定板中測定熒光。從溫育管汲取溶液(200μL)并將其置于黑色微量滴定板中(Dynatek Laboratories，Chantilly，VA)。然后用Fluoroskan II熒光計(Flow Laboratories，McLean，VA)直接對平板讀數，對于熒光素用495nm的激發波長并且在520nm處監測發射光，對于德克薩斯紅用591nm的激發波長并且在612nm處監測發射光，并且麗絲胺或TAMRA用570nm的激發波長并且在590nm處監測發射光。洗脫的寡核苷酸的量通過用測得的熒光量〔3.84個相對熒光單位(rfu)〕除以德克薩斯紅寡核苷酸的比活(每μg寡核苷酸6.9rfu)加以測定。因此測得陣列中的每單元中存在108個寡核苷酸。
從前述應當理解，雖然在此為了舉例說明的目的描述了本發明的具體實施例，但在不偏離本發明精神和范圍的情況下可進行各種修飾。因此，除了所附的權利要求外，本發明不受其它限制。
權利要求
1.一種彈性探頭，包括包住壓縮彈簧的管狀套殼，所述彈簧與活塞機械連接，所述活塞具有伸出所述套殼的第一個區域，所述第一個區域包括以平坦表面終止的錐形端部，所述表面與所述套殼的縱軸垂直，所述錐形端部在其剖面具有與上述表面相鄰接的外側邊，如果上述外側邊越過上述表面延伸，則相交于距上述表面約0.001-0.005英寸處的點。
2.權利要求1所述的彈性探頭，其中錐形端部選自角錐形、輻射形、圓錐形、針形和凹槽形設計。
3.權利要求1所述的彈性探頭，其中錐形端部為凹槽形。
4.權利要求1所述的彈性探頭，其中錐形端部包括金制表面。
5.一種組合物，包含基于組合物總體積約35體積％至80體積％濃度的增稠劑、0.001μg/mL到10μg/mL濃度的寡核苷酸以及水。
6.權利要求5所述的組合物，其中增稠劑是具有至少三個羥基的多元醇。
7.權利要求6所述的組合物，其中多羥基醇選自甘油、三羥甲基丙烷、三羥甲基乙烷、季戊四醇和糖類。
8.權利要求7所述的組合物，其中糖類選自甘露醇、蔗糖、果糖、乳糖、纖維素和谷物糖漿。
9.權利要求5所述的組合物，其中增稠劑是以40體積％到60體積％濃度存在的甘油。
10.權利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸濃度為0.01μg/mL到1μg/mL。
11.權利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸濃度為0.05μg/mL到0.5μg/mL。
12.權利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸包含15到50個核苷酸。
13.權利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸包含50到1,000個核苷酸。
14.權利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸是單鏈。
15.權利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸是雙鏈。
16.權利要求5所述的組合物，其中寡核苷酸在其5’末端帶有氨基(-NH2)。
17.權利要求16所述的組合物，其中寡核苷酸在其5’末端帶有己胺(-(CH2)6-NH2)基團。
18.權利要求16所述的組合物，進一步包含三氯三嗪。
19.權利要求5所述的組合物，具有7到9的pH并且進一步包含緩沖劑。
20.權利要求19所述的組合物，其中緩沖劑選自磷酸鈉、硼酸鈉、碳酸鈉和Tris HCl。
21.權利要求5所述的組合物，具有18-25℃的溫度。
22.權利要求5所述的組合物，具有20℃時約6厘泊到25℃時約80厘泊的粘度。
23.一種將生物分子點樣到固體支持物上的方法，此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉移到所述固體支持物上；其中所述彈性探頭包括包住壓縮彈簧的管狀套殼，所述彈簧與活塞機械連接，所述活塞具有伸出所述套殼的第一個區域，所述第一個區域包括以平坦表面終止的錐形端部，所述表面與所述套殼的縱軸垂直，所述錐形端部在其剖面具有與上述表面相鄰接的外側邊，如果上述外側邊越過上述表面延伸，則相交于距上述表面約0.001-0.005英寸處的點。
24.權利要求23所述的方法，其中所述的生物分子是寡核苷酸并且所述的溶液包含基于組合物總體積約35體積％至80體積％濃度的增稠劑、0.001μg/mL到10μg/mL濃度的寡核苷酸以及水。
25.權利要求23所述的方法，其中所述的固體基質包括平面，并且所述平面至少部分覆蓋有一層與生物分子接觸的聚乙烯亞胺(PEI)。
26.權利要求23所述的方法，其中所述的接觸步驟重復至少10次且其中不插入浸入步驟。
27.一種排列生物分子的方法，包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉移到所述固體支持物上；并且重復所述接觸步驟多次以使生物分子以陣列形式排列于固體支持物上；其中所述彈性探頭包括包住壓縮彈簧的管狀套殼，所述彈簧與活塞機械連接，所述活塞具有伸出所述套殼的第一個區域，所述第一個區域包括以平坦表面終止的錐形端部，所述表面與所述套殼的縱軸垂直，所述錐形端部在其剖面具有與上述表面相鄰接的外側邊，如果上述外側邊越過上述表面延伸，則相交于距上述表面約0.001-0.005英寸處的點。
28.權利要求27所述的方法，其中陣列包括包含平面的固體基質；所述平面至少部分覆蓋有一層聚乙烯亞胺(PEI)；所述涂層包括多個由第二區環繞并與其鄰接的分開的第一區；所述第一區有生物分子和PEI；并且所述第二區有PEI并且基本上沒有生物分子。
29.權利要求28所述的方法，其中雙功能偶聯劑的反應產物置于所述平面與所述PEI涂層之間，所述反應產物與所述平面和所述PEI涂層共價結合。
30.權利要求28所述的方法，其中所述陣列有多個第一區，選自10到50個第一區，50到400個第一區和400個以上第一區。
31.權利要求27所述的方法，其中所述的固體支持物包括其上具有包括聚乙烯亞胺(PEI)的涂層的平面，所述生物分子溶液與所述PEI接觸。
32.權利要求31所述的方法，在所述重復步驟后進一步包括用琥珀酸酐處理所述涂層的步驟。
33.權利要求32所述的方法，在所述處理步驟后進一步包括將所述涂層與甘油一起溫育的步驟。
34.權利要求33所述的方法，在所述溫育步驟后進一步包括用水性去污劑溶液清洗所述涂層的步驟。
35.權利要求32所述的方法，在所述處理步驟后進一步包括在80-95℃加熱所述涂層的步驟。
全文摘要
一種用于將生物分子點樣到固體支持物上的方法,此方法包括以下步驟:將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中;將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上;并且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉移到所述固體支持物上。彈性探頭雖然具有平坦的端部,但在其它方面與商業彈性探頭相同。生物分子溶液除了含有生物分子之外還含有增稠劑,其中寡核苷酸分子是優選的生物分子。
文檔編號B01L3/00GK1264319SQ98807432
公開日2000年8月23日 申請日期1998年7月21日 優先權日1997年7月22日
發明者K·莫伊尼漢, J·范尼斯, J·C·泰伯恩 申請人:拉普吉恩公司