專利名稱：一種制備分離基質的方法
技術領域：
本發明涉及通過吸附到分離基質上而分離例如蛋白質或其它有機化合物的分子。更加具體地，本發明涉及制備這種分離基質的方法，其中所述分離基質包括其上已經連接有聚合物配體的基礎基質。
背景技術：
色譜法包括一族緊密相關的分離方法。使色譜法區別于絕大多數其它物理和化學分離方法的特征在于使兩個相互不混溶的相發生接觸，其中一個相是固定相，另一個相是流動相。引入流動相中的樣品混合物，在由流動相運載通過系統時經歷很多次固定相和流動相之間的一系列的相互作用。相互作用是利用了樣品中組分的物理或化學性質的差別。這些差別決定了在移動通過含有固定相的柱子的流動相的影響下單個組分的遷移速率。被分開的組分按照與固定相的相互作用增加的順序出現。阻滯最小的組分首先洗脫，被最強烈地保留的物質最后洗脫。當一個組分被充分阻滯，從而防止與作為從柱子洗脫的樣品組分的相鄰溶質的區域重疊時，可以實現分離。固定相通常由擔體(support)或基礎基質(也稱為載體)組成，其中含有官能團(即相互作用基團)的配體已經連接到所述基礎基質(base matrix)。通常可以基于所利用的相互作用原理來指稱各種色譜法。
例如，離子交換色譜法是基于電荷-電荷相互作用。在陰離子交換色譜法中，目標化合物的帶負電的基團將與色譜基質的帶正電的配體發生相互作用。另一方面，在陽離子交換色譜法中，目標化合物的帶正電的基團將與色譜基質的帶負電的配體發生相互作用。親和色譜法是基于配體和目標化合物之間的生物親和力，例如酶-受體相互作用和抗體-抗原相互作用。蛋白質A色譜法是公知的親和色譜法，其中含有蛋白質A的配體與目標抗體的Fc片段發生相互作用。此類蛋白質A配體方便地由重組DNA技術制備。目標化合物和存在于固定相上的金屬螯合基團之間的相互作用被用于固定的金屬離子吸附色譜法(IMAC)，其通常用于純化蛋白質。已知多種螯合基團被用于IMAC中，例如亞氨基二乙酸(IDA)和次氮基三乙酸(NTA)。在親硫吸附色譜法中，與含有游離巰基的配體連接的由二乙烯基砜活化的基礎基質在易溶鹽(lyotropic salt)的存在下吸附免疫球蛋白。最近，已經顯示巰基的硫醚可以被氮或氧代替。在疏水相互作用色譜法(HIC)中，分離基質包含疏水基團。在反相色譜法(RPC)中，使用完全疏水的基質。
更新的一種色譜法是利用連接到基礎基質上的刺激-響應聚合物。所述刺激-響應聚合物，也稱為“聰明聚合物(intelligent polymers)”，當暴露于適當的刺激時將經歷它們物理化學性質的結構上的和可逆的變化。所述刺激可以是例如溫度變化、光、磁場、電場和振動。用于色譜法中的刺激-響應聚合物已經被提出，參見例如Palmgren，Ronnieet alStimulus-responsive polymers used in chromatographicseparation”Abstracts of papers，225thACS National Meeting，NewOrleans，LA，United States，CAPLUS accession no.2003179083和專利申請SE 0300791-1，其中公開了在疏水相互作用色譜法中使用pH-響應聚合物。
此外，US 5998588公開了一種相互作用分子共軛物，其例如是刺激-響應聚合物和親和組分的組合。所公開的聚合物優選通過乙烯基-類型單體的鏈轉移引發的自由基聚合制備。所述聚合物的分子量可以通過改變關鍵反應物的濃度和聚合條件進行控制。但是，所建議的聚合方案將導致相對寬的聚合物鏈長分布。
美國專利4581429(Commonwealth Scientific and IndustrialResearch Organization)涉及例如作為表面涂料例如高固體或無溶劑表面涂料、用于粘合劑和作為增塑劑等的聚合物的制備。更加具體地，公開的是一種可以實現對聚合過程的增長步驟進行改進的控制的方法。所述改進的控制允許例如得到鏈長度低于200單體單元的聚合物，這在該領域在1984年之前被認為是一個難題。增長步驟的控制通過使用自由基引發劑實現，該自由基引發劑包括至少一個其上可以存在自由基官能的碳原子。更加具體地，所述引發劑可以包括例如叔丁基、氰基異丙基、苯基、甲基等等的基團。所公開的方法被稱為可控自由基聚合(CRP)，并且使得能夠制備多分散指數接近1的聚合物。
最近，其它研究的焦點在于對產物具有改進的控制的特定聚合方法的研發。所以，聚合物鏈的逆終止(reverse termination)已被用于硝基氧(nitroxide)調控的聚合(NMP)(也稱為穩定自由基聚合(SFRP))中，該方法已經特別被用于基于苯乙烯的共聚物的合成。NMP已經被建議用于例如合成官能化的三維大分子，例如納米顆粒，用于包裹和螯合多種客體分子的支架(scaffolds)等。
可逆加成斷鏈鏈轉移(RAFT)聚合(reverse addition-fragmentationtransfer polymerisation)是最近以來的特定的可控自由基聚合方法的另一個例子，其尤其公開于在納米顆粒制備的上下文中。
US 5763548(Carnegie-Mellon University)公開了通過轉移到金屬絡合物的配體而具有可逆終止的自由基聚合，其被稱為原子轉移自由基聚合(ATRP)。更加具體地，ATRP，其基于過渡金屬絡合物例如Cu(I)(II)之間的氧化還原反應，提供了苯乙烯、(甲基)丙烯酸酯和其它自由基可聚合單體的活性或可控自由基聚合。更加具體地，使用各種簡單的有機鹵化物作為引發劑和使用過渡金屬絡合物作為催化劑，這種活性自由基聚合提供了具有預定數均分子量和窄分子量分布的聚合物。
此外，Kim等人(Dong Jin Kim，Jin-yound Heo，Kwang Soo Kim，and Insung S.Choi in Macromol.Rapid Commun.2003，24，517-521Formation of Thermoresponsive Poly(N-isopropylacrylamide)/DextranParticles by Atom Transfer Radical Polymerisation)公開了接枝聚合物到控制生物相互作用例如細胞粘附的表面。更加具體地，Kim等人公開了表面引發的水性原子轉移自由基聚合，其通過將聚合引發劑連接到葡聚糖微球上并聚合N-異丙基丙烯酰胺實現。所得的雜化顆粒直徑為約250μm并顯示出熱響應性。所建議的應用是表面粘附改性劑、活性藥物靶定裝置、生物化學觸發的調節器或閥、細胞培養和組織工程的支持物。
WO 01/09204(Symyx Technologies)公開了通過活性類型或半活性類型的自由基聚合制備可控結構聚合物的方法。更加具體地，公開的結構化聚合物由具有在電泳分離系統中有利的性質的聚丙烯酰胺重復單元組成，這是因為與具有相同重復單元的線形非交聯聚合物相比，所述部分支化或交聯的聚合物的篩分能量得到增強。
發明簡述本發明的一個方面是合成具有可控分子量的聚合物色譜配體的方法。
本發明的另一個方面是合成具有可控結構、可控組成和/或可控官能團的聚合物色譜配體的方法。
本發明進一步的方面是合成具有窄多分散性的聚合色譜配體的方法。
本發明的其他方面和優點將在后面的詳細描述中顯現出來。
附圖簡述

圖1提供了通過ATRP制備ω-溴端基-官能的聚苯乙烯的合成方案。
圖2示出了制備ω-硫醇鹽端基-官能的聚苯乙烯的合成方案。
圖3示出了將ω-硫醇鹽端基-官能的聚苯乙烯連接到經活化的瓊脂糖顆粒上的合成方案。
圖4示出了在現有技術分離介質上四種蛋白質(肌紅蛋白(1)、核糖核酸酶A(2)、α-乳白蛋白(3)和α-糜蛋白酶原A(4))的對比洗脫圖。
圖5示出了在現有技術分離介質High Sub Phenyl SepharoseTM6FF(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上四種蛋白質(如圖4中所定義)的對比洗脫圖。
圖6示出了在如下所述的本發明凝膠1上四種蛋白質(如圖4中所定義)的洗脫圖。
定義術語“從......接枝”在本文中用作表面引發的單體聚合。
術語“接枝到”用作將聚合物連接到表面上。
術語“基礎基質”在本文中是指一種載體材料，可以將配體連接到其上以提供分離基質。
術語“分離基質”在本文中是指配體已經連接到其上的基礎基質。術語“配體”以其在色譜領域的常規意義進行使用，即作為含有一個或多個能夠與目標發生相互作用的官能團的側鏈基團。在本文中，術語“相互作用”可以是結合(一般表示為吸附)，或者是選擇性阻滯。
術語“凝膠”在本文中用作凝膠形式的分離基質。
術語聚合“引發劑”本文中是指在鏈聚合過程中能夠作為原子轉移前體的化合物。
術語聚合“催化劑”本文中是指在鏈聚合過程中能夠作為原子轉移促進劑的化合物。
術語“多分散性”是指分子量分布，定義為重均分子量除以數均分子量(Mw/Mn)。
發明詳述本發明的第一方面是制備分離基質的方法，所述方法包括(a)提供包含一個或多個色譜官能團的不飽和單體；(b)使所述單體與引發劑和催化劑接觸；(c)對所述單體實施可控自由基聚合；(d)將所得聚合物連接到基礎基質上。
所述不飽和單體可以是任何能夠進行可控自由基聚合的單體，并且可容易地由本領域的技術人員進行選擇。在一個實施方案中，在步驟(a)中，提供單體的混合物，其中至少一種含有至少一個色譜官能團(functionality)。因此，從步驟(c)得到的聚合物可以是共聚物，嵌段聚合物，例如無規、嵌段、梯度、星形、接枝或梳形共聚物，以及超支化和樹枝形聚合物或共聚物。制備共聚物的單體組合的說明性例子是甲基丙烯酸乙酯-苯乙烯和甲基丙烯酸乙酯-丙烯酰胺。在一個實施方案中，從步驟(c)得到的聚合物是被取代的。
在本發明方法的一個實施方案中，在步驟(a)中，提供含有一個或多個疏水色譜官能團的單體。在本文中，應理解的是術語“單體”是指一類單體。因此，在本發明方法的有利實施方案中，步驟(a)包括苯乙烯類單體(styrene monomers)和任選的一種或多種額外的不飽和單體。在一個具體實施方案中，所述單體選自苯乙烯、五氟苯乙烯、4-甲基苯乙烯、4-叔丁基苯乙烯、4-(三氟甲基)苯乙烯和縮水甘油基乙烯基芐基醚。所以，在本發明方法的一個實施方案中，分離基質是疏水相互作用(HIC)分離基質。因此，在這種情況下，每個單體單元將提供一個疏水官能團。但是，可選擇的，步驟(a)可以包含兩種或多種單體的混合物。適合與上述單體混合的其它不飽和單體對本領域的技術人員來說是公知的，包括例如甲基丙烯酸羥乙酯。
疏水基質的一種特定情況是適合用于反相色譜法(RPC)的基質，該色譜法使用比HIC更加強烈的疏水的基質。在該實施方案中，一些說明性單體是對辛基苯乙烯、對環己基苯乙烯、對十二烷基苯乙烯和對異丙基苯乙烯。
在可選擇的實施方案中，對單體進行選擇從而從步驟(c)得到的聚合物是如上所述的刺激-響應聚合物。因此，在該實施方案中，單體是例如N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)，并且得到的聚合物是溫度響應聚合物。在另一個實施方案中，單體是丙烯酸(AAc)。在該實施方案中，從步驟(c)得到的聚合物是pH敏感的聚合物。在一個有利的實施方案中，從步驟(c)得到的聚合物是包含疏水官能團的pH響應聚合物，例如SE0300791-1(WO 2004/07831)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)所公開的那樣，該文獻引入本文作為參考。因此，在一個實施方案中，分離基質包含pH響應聚合物。
如本領域技術人員將會理解的那樣，任何其它種類的色譜官能團可以同樣地存在于不飽和單體之上以提供其它種類的分離基質。因此，色譜官能團可以是例如離子交換基團、親和基團、IMAC基團、混合型的配體等等。例如，親和配體合適地由例如丙烯酰氨基鯡精胺和丙烯酰氨基芐脒的單體制備；以及離子交換配體可以由提供有離子交換基團或被保護的離子交換基團的丙烯酸叔丁酯或甲基丙烯酸叔丁酯制備。本領域的技術人員對于期望的目的可以容易地選擇最合適的單體，并且如果需要還可以包括任何額外的步驟例如去保護。
如以上所述，步驟(c)是不飽和單體的可控自由基聚合。可控自由基聚合的概念在聚合物化學領域是公知的，很多教科書都詳細描述了一般概念和各種實施方案，參見例如“Handbook of radicalpolymerisation”2002，Edited by Krzysztof Matyjaszewski and ThomasP.Davies，Wiley Intersciences，其引入本文作為參考。簡單來說，與逐步聚合相反，可控自由基聚合(CRP)產生具有預定平均分子量和窄多分散性(polydispersities)的聚合物。CRP方法中的增長快速達到最終大小，該最終大小由單體引發劑比率決定。因此，在一個實施方案中，單體引發劑比率為1/5-1/200。
本發明首次提出，通過使用可控自由基聚合制備被良好限定的配體，接著將所得配體通過“接枝到”技術連接到基礎基質，來制備分離基質。因此，所述可控自由基聚合步驟使得可以制備具有可控結構、組成和官能團的聚合物色譜配體。如以上所述，常規而言聚合物色譜配體通過“從......接枝”技術制備，其中在基礎基質表面引發常規步驟聚合。這種技術之所以得到廣泛使用，大概是由于常規色譜基質中的配體的精確組成并不重要。因此，容易制備使得由“從......接枝”步驟聚合的配體處于有利地位。但是，隨著新型聚合物配體例如刺激-響應聚合物的最近的發展，出現了一個以前不知道的問題，即如何制備被更加良好限定的配體。配體的精確本性對實際的色譜性能越重要，那么該問題就越重要。例如，在HIC中，目標化合物的結合強度將取決于能夠接觸每個目標化合物的疏水官能團的數目，并且為了實現有效洗脫需要控制結合強度。
在本發明方法的一個實施方案中，步驟(b)包括催化劑并且所述引發劑包括有機鹵化物基團。說明性的引發劑是烷基鹵、芳基鹵和鹵代烷基酯。此類鹵化物的一個具體例子是1-苯基乙基溴，其是可商購的，例如從Aldrich。在一個具體實施方案中，所述催化劑是過渡金屬絡合物并且可控聚合是原子轉移自由基聚合(ATRP)。所述催化劑可以是能夠參予與引發劑和休眠聚合物鏈的氧化還原循環但是不與聚合物鏈形成直接的碳-金屬鍵的任何過渡金屬化合物。所以，過渡金屬絡合物可以選自Cu(I)/Cu(II)；Fe(II)/Fe(III)；Ru(II)/Ru(III)；Cr(II)/Cr(III)；Mo(0)/Mo(I)；Mo(II)/Mo(III)；W(II)/W(III)；Rh(III)/Rh(IV)；Co(I)/Co(II)；Re(II)/Re(III)；Ni(0)/Ni(I)；Mn(III)/Mn(IV)；V(II)/V(III)；Zn(I)/Zn(II)；Au(I)/Au(II)和Ag(I)/Ag(II)。在ATRP中，不飽和的單體可以是任何自由基可聚合的烯，例如(甲基)丙烯酸酯、苯乙烯和二烯。合適單體和其它ATRP條件的更加詳細的選擇可在上述美國專利5763548中找到，其中ATRP被建議用于制備塑料、彈性體、粘合劑等等。
在一個有利的實施方案中，所述方法還包括提供對經活化的基礎基質具有反應性的基團的所述聚合物的步驟。在一個實施方案中，這在早期階段通過使用含有此類基團的引發劑實現。在第二實施方案中，這通過使用含有此類基團的反應性單體實現。在可選擇的實施方案中，這在后面的階段通過用對經活化的基礎基質具有反應性的基團代替所述聚合物的端基鹵化物實現。該可選擇的實施方案優選作為在上述步驟(c)和(d)之間的步驟實施，并且有利地在例如如果步驟(c)采用ATRP實施的情況下使用。代替基團的一些例子包括例如疊氮基、氨基、巰基、羥基、羧酸等等。因此，在步驟(d)中，在一個具體實施方案中，通過將在聚合物末端得到的鹵化物基團轉化為硫醇基，可以容易地將通過ATRP制備的聚合物連接到基礎基質上。
根據已知方法，含有對經活化的基礎基質具有反應性的基團的聚合物被方便地連接到烯丙基活化的、環氧基活化的或硫醇活化的基礎基質上。對適合于將聚合物連接到基礎基質上的技術的綜述，參見例如Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson et al，Gret T.Heranson，A.Krishna Malia and Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992，其引入本文作為參考。
在可選擇的實施方案中，可控聚合是硝基氧調控的聚合(NMP)。NMP以前在納米顆粒領域被提出，在該領域中其多功能性使得能夠制備適合用于構建限定的材料的三維大分子結構。NMP是可逆鏈聚合方法，可逆鏈聚合方法是指可逆的聚合-解聚平衡。可用于NMP中的不飽和單體是上述討論的任一種，例如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯等等的單體。
在另一個可選擇的實施方案中，可控聚合是可逆加成斷鏈鏈轉移(RAFT)聚合。RAFT聚合方法是作為制備活性(living)均聚物、嵌段和星形聚合物的有力的和工業友好的路徑出現的。所述方法包括例如在硫代羰基硫化合物的存在下的常規自由基聚合。可用于RAFT中的不飽和單體是上述討論的任一種，例如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯等等的單體。
在本發明方法的一個實施方案中，聚合步驟(c)的產物的多分散指數(PDI)低于約1.4，優選低于約1.3。因此，本發明提供了制備聚合物色譜配體的方法，其中分子量分布顯著低于被建議用于該目的的任何其它方法。
從步驟(c)得到的聚合物可以是任何合適的長度，其可以由本領域的技術人員容易地調節到期望的值。在一個實施方案中，聚合物的大小為500g/mol-50000g/mol。聚合物的長度將取決于如此制備的分離基質的期望的性質。因此，需要考慮在共聚物的情況下每種官能團的頻率以及需要考慮具體官能團的性質。如本領域技術人員將會容易地理解的那樣，如果例如準備制備HIC基質，那么聚合物的長度將取決于官能團的疏水性以及任何其它單體的存在。但是，本發明的必要特征不是所使用的實際數量或單體單元，而是包含良好限定的配體的基質的這種設計。如上所述，用于從基礎基質合成聚合物配體的現有技術聚合步驟不能制備良好限定的色譜配體。
所述基礎基質可以是任何合適的形式，例如顆粒，優選基本為球形的顆粒，單塊(monoliths)，薄膜，過濾器(filters)，碎片(chips)，毛細管或任何其它表面。所述基礎基質優選是多孔的，在這種情況下從步驟(c)得到的配體被連接到基質的外表面和連接到可以到達的孔表面。因此，在本發明方法的一個實施方案中，基礎基質由直徑低于約100μm例如低于約90μm的多孔顆粒組成。因此，說明性的顆粒直徑范圍是0-100μm，例如20-80μm，例如30-50μm或50-70μm。在一個有利的實施方案中，顆粒是多孔的。
在本發明方法中使用的基礎基質可以由有機或無機材料例如有機聚合物制成。因此，在一個實施方案中，基礎基質由交聯的碳水化合物材料制成，例如瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、魔芋(konjac)、角叉菜聚糖、結冷膠(gellan)、藻酸鹽等等。此類基礎基質可以由本領域技術人員根據標準方法容易地進行制備，例如反相懸浮凝膠化(S HjerténBiochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)，其引入本文作為參考。或者，基礎基質是可商購的產品，例如來自AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden的SepharoseTMFF、SepharoseTMHP或SephadexTM，該公司提供很多其它同樣適合用于本發明方法中的基礎基質。因此，在本發明基質的一個實施方案中，擔體是交聯的多糖。在一個具體實施方案中，所述多糖是瓊脂糖。這些碳水化合物材料在固定配體之前通常被烯丙基化。概括而言，烯丙基化可以遵照標準方法用烯丙基縮水甘油基醚、烯丙基溴或任何其它合適的活化劑進行。
在可選擇的實施方案中，用于本發明方法的基礎基質由有機聚合物組成，例如交聯的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺類、丙烯酸酯類、甲基丙烯酸酯類、乙烯基酯類、乙烯基酰胺類等等。此類基礎基質可由本領域技術人員根據標準方法容易地制備，參見例如”Styrene based polymer supports developed bysuspension polymerization”(R ArshadyChimica e L’industria 70(9)，70-75(1988))，其被引入本文作為參考。或者，用于本發明方法的基礎基質是可商購的聚合物基質，例如來自Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden的SourceTM，該公司提供很多其它同樣適合用于本發明方法中的基礎基質。
最后，本發明的通過可控自由基聚合制備的聚合物配體可以連接到無機基礎基質，例如二氧化硅、磁顆粒、碳納米管等等。如本領域的技術人員將會理解的那樣，一些材料可能需要一些常規化學改性。
在一個可選擇的實施方案中，分離基質是包覆有聚合物的基礎基質，其中所述聚合物通過可控自由基聚合制備并接著接枝到所述基礎基質。包覆類型的分離基質作為具有延伸劑(extenders)或具有柔軟支臂(arms)的珠子、觸手凝膠等等是已知的。可以提供此類包覆層以在空間上允許相對大的目標化合物與基質發生相互作用，或者改變基礎基質的總體性質，例如從疏水改變為親水。
在第二方面，本發明涉及如上所述制備的分離基質。在一個實施方案中，本發明的分離基質是疏水相互作用(HIC)基質。在另一個實施方案中，從步驟(c)得到的聚合物是刺激-響應聚合物。在一個具體實施方案中，從步驟(c)得到的聚合物是pH-響應聚合物，例如包含疏水官能團的pH-響應聚合物。
本發明的分離基質可以用于分離生物分子，例如蛋白質，例如單克隆或多克隆抗體，肽，例如二肽或低聚肽，核酸，例如DNA或RNA，肽核酸，病毒，細胞，例如細菌細胞，朊病毒(prions)等等。或者，所述分離基質可用于分離有機分子，例如候選藥物。在一個可選擇的實施方案中，本發明的分離基質可用于識別任何一種上述討論的目標化合物，例如用于診斷目的。因此，使用本發明分離基質純化的產物可以是藥物或藥物靶(drug targets)；用于治療中的載體(vectors)，例如用于基因治療中的質粒或病毒；營養添加劑(feed supplements)，例如官能化的食物；診斷劑等等。根據本發明純化的生物分子的具體應用是個性化醫藥的藥物。
本發明的分離基質還可以用于從不希望的目標化合物例如上述的那些純化期望得到的液體。
最后一個方面，本發明涉及含有上述分離基質的色譜柱。液相色譜的原理對于本領域的技術人員來說是公知的，包括吸附步驟和通常包括洗脫步驟。優選地，在所述步驟之間將對所述分離基質進行洗滌。如本領域技術人員將認識到的那樣，緩沖液的性質和所使用的條件將取決于分離基質特別是聚合物配體的性質。
在一個實施方案中，本發明的色譜柱是稱為“有限使用”色譜柱的類型，其在本發明中是指最適合使用有限的次數例如1-10次的填充色譜柱。在本文中，最適合是指為了得到與原始產品類似的性能，可以得到有限的使用次數。此類有限使用產品商業上稱為“一次性產品”。
附圖詳述圖1提供了通過ATRP制備ω-溴端基-官能的聚苯乙烯的合成方案。
圖2示出了制備ω-硫醇鹽端基-官能的聚苯乙烯的合成方案。
圖3示出了將ω-硫醇鹽端基-官能的聚苯乙烯連接到經活化的瓊脂糖顆粒上的合成方案。
圖4示出了在現有技術分離介質Low Sub Phenyl SepharoseTM6FF(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上四種蛋白質(肌紅蛋白(1)、核糖核酸酶A(2)、α-乳白蛋白(3)和α-糜蛋白酶原A(4))的對比洗脫圖。
圖5示出了在現有技術分離介質High Sub Phenyl SepharoseTM6FF(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)上四種蛋白質(如圖4中所定義)的對比洗脫圖。
圖6示出了在本發明凝膠1上四種蛋白質(如圖4中所定義)的洗脫圖。
更加具體地，圖4-6示出了使用現有技術分離介質(Low Sub PhenylSepharoseTM6 Fast Flow和High Sub Phenyl SepharoseTM6 FastFlow，Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)(分別是圖4和5)和一種根據本發明制備的HIC介質(圖6)的四種蛋白質(肌紅蛋白、核糖核酸酶A、α-乳白蛋白和α-糜蛋白酶原A)洗脫圖的說明性對比。在相同的條件下將樣品施加到柱子上，并且在所有情況下使用線性梯度降低鹽濃度進行洗脫。
實驗部分本發明的實施例僅是用于說明目的，不應該理解為限制后附權利要求定義的本發明的范圍。
實施例1通過ATRP合成ω-溴端基-官能的聚苯乙烯在磁力攪拌下，在圓底燒瓶中混合苯乙烯(St)(20.8g，200mmol，20eq.)、溴化亞銅(CuBr)(1.434g，10mmol，1eq.)和2，2’-聯吡啶(Bipy)(3.436g，22mmol，2.2eq.)。該溶液用氮氣或azote gas吹掃15分鐘.將(1-溴乙基)苯(1-PeBr)(1.85g，10mmol，1eq.)加入到燒瓶中，然后將其密封。將反應從室溫加熱到110℃并進行5小時。然后冷卻反應混合物并將聚合物溶于CH2Cl2中。使該溶液流過短的二氧化硅柱。蒸發溶劑得到粘稠的粗產物。將該粗產物溶于最少量的CH2Cl2中，通過在MeOH(MeOH體積＝10倍CH2Cl2的體積)再沉淀CH2Cl2相而得到聚合物。在玻璃過濾器上過濾沉淀的聚合物并在50℃在真空下進行干燥。
Mn＝2000gmol-1；PDI＝1.26實施例2ω-硫醇鹽(thiolate)端基-官能的聚苯乙烯的合成在磁力攪拌下在圓底燒瓶中將實施例1的ω-溴端基-官能的聚苯乙烯(4g，2mmol，1eq.)溶于DMF(30ml)中。將該溶液加熱到100℃并用氮氣吹掃15分鐘。將硫脲(0.305g，4mmol，2eq.)加入到燒瓶中，然后將其密封。反應在100℃過夜。將溶于水(1ml)的NaOH(0.16g，4mmol，2eq.)加入到燒瓶中并使反應在95℃過夜。然后將反應混合物冷卻并加入CH2Cl2。然后用飽和NaCl水溶液萃取有機相三次。然后用MgSO4干燥有機相并在玻璃過濾器上過濾。蒸發溶劑，將得到的粗產物溶于最少量的CH2Cl2中。通過在MeOH(MeOH體積＝10倍CH2Cl2的體積)再沉淀CH2Cl2相而得到聚合物。在玻璃過濾器上過濾沉淀的聚合物并在50℃在真空下進行干燥。
Mn＝2000gmol-1；PDI＝1.28實施例3凝膠1在經活化的SepharoseTM6FF上連接ω-硫醇鹽端基-官能的聚苯乙烯(Mn＝2000gmol-1)根據公知的標準方法得到溴化的SepharoseTM6 Fast Flow。然后，用溴活化5ml(0.325mmol烯丙基基團)烯丙基化的SepharoseTM6 FastFlow(攜帶量是65μmol/ml凝膠)。活化之后，用丙酮洗滌凝膠并吸干。
將實施例2的ω-硫醇鹽端基-官能的聚苯乙烯(3.25g，1.625mmol，相對于烯丙基基團5eq.)溶于丙酮(10ml)中并將三乙胺(0.33g，3.25mmol，相對于烯丙基基團10eq.)加入該溶液中。將經活化的凝膠和所述聚合物溶液混合在一起并將混合物在50℃振蕩過夜。然后用丙酮、乙醇和水洗滌凝膠1直到除去沒有連接的聚合物。
實施例4HIC的色譜評價所有的實驗都在室溫下使用裝有Unicorn 3.1軟件的KTATMExplorer 100色譜系統(Amersham Biosciences AB)進行。
使用運行于1ml/min的在來自Amersham Biosciences AB的5/5HR柱中的1-2ml凝膠。所述方法包括使用2M(NH4)2SO4+0.1M磷酸鉀(pH7)的A緩沖液，加上另一種0.1M磷酸鉀(pH7)的B緩沖液。四種蛋白質，肌紅蛋白(0.5mg/ml)、核糖核酸酶A(2mg/ml)、α-乳白蛋白(0.5mg/ml)和α-糜蛋白酶原A(0.8mg/ml)，在A緩沖液中混合并施加到柱子上。然后柱子用A緩沖液2ml運行，接著施加在20ml中從100％A到100％B的梯度。
參比凝膠的色譜圖，Low Sub Phenyl SepharoseTM6 Fast Flow和High Sub Phenyl SepharoseTM6 Fast Flow，分別示于圖4和圖5中。
用SepharoseTM6 Fast Flow基礎基質制備的凝膠1色譜圖示于圖6中。本發明的凝膠工作于上述測試HIC條件下并表現出與現有技術參比凝膠不同的洗脫曲線。
色譜圖的圖標1肌紅蛋白2核糖核酸酶A3α-乳白蛋白4α-糜蛋白酶原A
權利要求
1.一種制備分離基質的方法，所述方法包括a)提供包含一個或多個色譜官能團的不飽和單體；b)使所述單體與引發劑和催化劑接觸；c)對所述單體實施可控自由基聚合；和d)將所得聚合物連接到基礎基質上。
2.權利要求1的方法，其包括提供具有對經活化的基礎基質具有反應性的基團的所述聚合物。
3.權利要求1或2的方法，其中在步驟(a)中，提供包含一個或多個疏水色譜官能團的單體。
4.權利要求3的方法，其中步驟(a)包括苯乙烯類單體，和任選的一種或多種額外的不飽和單體。
5.前述權利要求任一項的方法，其中在步驟(b)中，所述引發劑包含鹵化物基團。
6.權利要求5的方法，其中所述催化劑是過渡金屬絡合物并且所述可控聚合是原子轉移自由基聚合(ATRP)。
7.權利要求1-4任一項的方法，其中所述可控聚合是硝基氧調控的聚合(NMP)。
8.權利要求1-4任一項的方法，其中所述可控聚合是可逆加成斷鏈鏈轉移(RAFT)聚合。
9.前述權利要求任一項的方法，其中聚合步驟(c)的產物的多分散指數(PDI)低于約1.4，優選低于約1.3。
10.前述權利要求任一項的方法，其中所述基礎基質包含多孔顆粒。
11.權利要求1-9任一項的方法，其中所述基礎基質包含多孔薄膜。
12.根據權利要求1-11任一項制備的分離基質。
13.權利要求12的分離基質，其是疏水相互作用(HIC)基質。
14.權利要求12的分離基質，其中從步驟(c)得到的聚合物是刺激-響應聚合物。
15.一種色譜柱，填充有權利要求12-14任一項的基質。
全文摘要
本發明是一種制備分離基質的方法，該方法包括提供包含一個或多個色譜官能團的不飽和單體；使所述單體與引發劑和催化劑接觸；對所述單體實施可控自由基聚合；和將所得聚合物連接到基礎基質上。所述可控聚合技術可以是例如ATRP、RAFT或NMP。所述方法允許制備良好限定的配體，可用于例如HIC或任何其它類型的色譜方法。
文檔編號B01J20/32GK1946479SQ200580012127
公開日2007年4月11日 申請日期2005年3月31日 優先權日2004年4月5日
發明者P·布森 申請人:通用電氣健康護理生物科學股份公司