2,7-二(4-乙烯基吡啶)-9-芴酮鹽類雙光子熒光細胞核定位探針材料及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及雙光子巧光細胞核定位探針材料及其制備方法與應用，具體是一種一 種2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位探針材料及其制備方法與 運用。
【背景技術】
[0002] 隨著生命科學的不斷發展，生物巧光成像技術在生命組織中的選擇性定位和標記 方面得到了廣泛的應用。尤其W生物巧光探針材料為主要研究對象的一類新型生物標記物 是當前生命科學在成像領域的研究熱點。相對于傳統的W紫外波段為激發光源的單光子巧 光探針由于細胞損傷大，成像分辨率低W及無法進行Ξ維高分辨成像等缺陷限制了其作為 巧光標記染料的應用。而雙光子巧光探針W近紅外為激發光源，激發波段位于生物光學窗 口，不僅對細胞損傷小，而且具有良好的空間選擇性和Ξ維成像能力，因此成為人們關注的 焦點。在眾多種類不同，標記位置各異的雙光子巧光探針材料中，對細胞核進行選擇性標記 的能力具有重要的科學意義。細胞核作為真核細胞的控制中屯、，是生命體中遺傳物質的主 要載體，在細胞的代謝，生長和分化中起著重要的作用。對細胞核中遺傳物質值NA)進行選 擇性標記能夠使我們有效實現病理學診斷，癌細胞檢測，細胞形態學研究，從而及時阻止疾 病惡化。
[0003] 在雙光子生物巧光成像過程中，對染色后細胞進行長時間實時動態觀測是研究細 胞生長、行為及形態變化等過程的重要科學手段。目前，商用的細胞核定位染色劑DAPI是 優良的單光子巧光生物探針，激發光波長位于358nm的近紫外區。但其作為雙光子巧光探 針時（激發光波長為740nm)，激發波段位于可見光波段（400~750nm)的非生物光學窗口。 同時其實時連續觀測時間有限，對于長時間實時連續動態觀測難W進行，從而限制了其在 雙光子Ξ維生物成像中的應用。
[0004] 本發明所制備的雙光子巧光細胞核定位探針新材料W2, 7-二漠-9-巧酬為中屯、 共輛橋，在其兩端對稱的接入具有良好電荷轉移能力的取代基團4-乙締基化晚，在增大了 分子鏈長度的基礎上，提升了分子的η共輛離域平面。作為雙光子巧光細胞核定位探針， 在雙光子生物巧光成像過程中，雙光子激發波長達到800皿左右的近紅外生物光學窗口， 減少了激發光的瑞利散射，并實現了長時間（3000秒W上）實時連續觀測能力，具有良好的 應用前景。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是為了解決現有商用巧光細胞核定位探針材料在性能方面存在的 難W進行長時間實時連續觀測，激發光位于可見光波段的非生物光學窗口W及激發光的瑞 利散射大等問題。而提供了 2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位 探針材料及其制備方法與應用。 陽006] 本發明的技術解決方案如下： 陽007] -種2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位探針材料，所 述的探針材料的結構式如下：
[0008]
[0009] 其中，R為邸3、C2H5或C化。
[0010] 一種制備所述的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位探 針材料的方法，包括如下步驟： W11] 步驟1、按質量百分比稱取23~26 %的2, 7-二漠-9-巧酬，24~27 %的4-乙 締基化晚，5~9%的Ξ鄰甲苯基麟，1~3%的醋酸鈕、38~42%的無水碳酸鐘，同時加入 15~20ml的N-甲基化咯燒酬，混合均勻后得到混合液，然后，加入到密閉的反應容器內，在 惰性氣體保護下將溫度逐漸升至125~135°C，保溫20~2地；
[0012] 反應結束后，用二氯甲燒充分萃取混合液，減壓蒸饋的粗產物，分別用乙酸乙醋： 石油酸=2~4:1W及乙臘：二氯甲燒=4~6:1兩種淋洗劑進行硅膠柱層析分離，得到紅 色中間產物；
[0013] 步驟2、取適量紅色中間產物作為底物，向其中加入20~30ml丙酬和3~6ml的 RI(ay、（：化1或〔品1)，在氮氣保護條件下，先在25~35°C條件下反應2~3h，然后將溫 度升至75~90°C，保溫12~15h;
[0014] 待冷卻后直接抽濾，得到澄紅色最終產物，即2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽 類雙光子巧光細胞核定位探針材料。
[0015] 本發明的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類衍生物作為雙光子巧光細胞核定 位探針材料應用于雙光子Ξ維生物巧光成像領域。
[0016] 本發明包含W下有益效果：
[0017] 本發明的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位探針材 料，在800~860nm的近紅外波段（生物光學窗口）雙光子飛秒激光激發下，探針材料均能 產生較強巧光。且在雙光子巧光成像過程中，探針材料可準確標記細胞核染色區域，核定位 清晰明顯。在飛秒激光持續激發下的巧光穩定且持久，實時連續觀測時間可達3000秒W 上。
【附圖說明】 陽01引圖1是具體實施例1得到的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細 胞核定位探針材料的紅外光譜圖；
[0019] 圖2是具體實施例2得到的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細 胞核定位探針材料的紅外光譜圖；
[0020] 圖3是具體實施例3得到的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細 胞核定位探針材料的紅外光譜圖；
[0021] 圖4是具體實施例1得到的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細 胞核定位探針材料的質譜圖；
[0022] 圖5是具體實施例2得到的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細 胞核定位探針材料的質譜圖；
[0023] 圖6是具體實施例3得到的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細 胞核定位探針材料的質譜圖；
[0024] 圖7是具體實施例1得到的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細 胞核定位探針材料的雙光子巧光細胞核成像圖；
[0025] 圖8是具體實施例2得到的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細 胞核定位探針材料的雙光子巧光細胞核成像圖；
[0026] 圖9是具體實施例3得到的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細 胞核定位探針材料的雙光子巧光細胞核成像圖。
【具體實施方式】
[0027] 本發明技術方案不局限于W下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0028] 一：本實施方式的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧 光細胞核定位探針材料的結構式如下：
[0029]
其中，R為邸3、C2H5或C化。
[0030] 本實施方式的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位探針 材料，在800~860nm的近紅外波段（生物光學窗口）雙光子飛秒激光激發下，探針材料均 能產生較強巧光。且在雙光子巧光成像過程中，探針材料可準確標記細胞核染色區域，核定 位清晰明顯。在飛秒激光持續激發下的巧光穩定且持久，實時連續觀測時間可達3000秒W 上。
【具體實施方式】 [0031] 二：本實施方式的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧 光細胞核定位探針材料的制備方法，是按照W下步驟進行的：
[0032] 一、按質量百分比稱取23~26%的2, 7-二漠-9-巧酬，24~27%的4-乙締基 化晚，5~9%的Ξ鄰甲苯基麟，1~3%的醋酸鈕、38~42%的無水碳酸鐘，同時加入15~ 20ml的N-甲基化咯燒酬。將上述物料混合均勻，加入到密閉的反應容器內。在惰性氣體 保護下將溫度逐漸升至125~135°C，保溫20~2地。反應結束后，用二氯甲燒充分萃取混 合液，減壓蒸饋的粗產物。分別用乙酸乙醋：石油酸=2~4:1W及乙臘：二氯甲燒=4~ 6:1兩種淋洗劑進行硅膠柱層析分離，得到紅色中間產物。
[0033]二、取適量中間產物作為底物，向其中加入20~30ml丙酬和3~6ml的RI(CH3I、 &馬1或C4H山，氮氣保護條件下，先在25~35°C條件下反應2~池，然后將溫度升至75~ 90°C，保溫12~15h。待冷卻后直接抽濾，烘干濾餅，得到澄紅色目標產物，即2,7-二（4-乙 締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位探針材料。
[0034] 本實施方式的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位探 針材料由W下兩步反應制取：（1) 2, 7-二漠-9-巧酬和4-乙締基化晚發生赫克反應化eck reaction)制備2, 7-二（4-乙締基R比晚）-9-巧酬；似2, 7-二（4-乙締基R比晚）-9-巧酬 和RI(I=CH3X2H5或C化）發生鹽化反應生成2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光 子巧光細胞核定位探針材料，其反應式為：
[0035]
[0036] 本實施方式的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位探針 材料，在800~860nm的近紅外波段（生物光學窗口）雙光子飛秒激光激發下，探針材料均 能產生較強巧光。且在雙光子巧光成像過程中，探針材料可準確標記細胞核染色區域，核定 位清晰明顯。在飛秒激光持續激發下的巧光穩定且持久，實時連續觀測時間可達3000秒W 上。
【具體實施方式】 [0037] Ξ:本實施方式與二不同的是：步驟一中所述的按質 量百分比稱取24. 5%的2, 7-二漠-9-巧酬，26. 5%的4-乙締基化晚，8. 5%的Ξ鄰甲苯基 麟，1. 5%的醋酸鈕，39%的無水碳酸鐘和15ml的N-甲基化咯燒酬。
【具體實施方式】 [0038] 四：本實施方式與二或Ξ不同的是：步驟一中所述的 溫度逐漸升至130°c。其它與二或Ξ相同。
【具體實施方式】 [0039] 五：本實施方式與二至四之一不同的是：步驟一中所 述的保溫2地。其它與二至四之一相同。
【具體實施方式】 [0040] 六：本實施方式與二至五之一不同的是：步驟一中所 述的分別用乙酸乙醋：石油酸=2:1W及乙臘：二氯甲燒=4:1進行硅膠柱層析分離。其它 與二至五之一相同。
【具體實施方式】 [0041] 屯：本實施方式與二至六之一不同的是：步驟二中所 述的加入25ml丙酬和4ml的RI。其它與二至六之一相同。
【具體實施方式】 [0042] 八：本實施方式與二至屯之一不同的是：步驟二中所 述的將溫度升至80°C。。其它與二至屯之一相同。
【具體實施方式】 [0043] 九：本實施方式與二至八之一不同的是：步驟二中所 述的保溫15h。其它與二至八之一相同。
【具體實施方式】 [0044] 十：本實施方式的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類衍生物作 為雙光子巧光細胞核定位探針材料應用于雙光子Ξ維生物巧光成像領域。
[0045] 本實施方式的2, 7-二（4-乙締基化晚）-9-巧酬鹽類雙光子巧光細胞核定位探針 材料，在800~860nm