本發明(ming)屬于熒光探針，特別涉(she)及一種熒光探針的(de)制備(bei)方法及其在檢測四環素、焦磷酸鹽離子中的(de)應用(yong)。

背景技術：

1、四環素(su)(su)(tetracycline,tc)是(shi)醫學領域最(zui)常用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)抗生(sheng)素(su)(su)，在(zai)控制和(he)預(yu)防細菌(jun)感(gan)染(ran)或(huo)傳染(ran)病(bing)方面具有(you)(you)成本(ben)低(di)、口服吸收(shou)好、對多種細菌(jun)有(you)(you)效等優點。然而，只有(you)(you)少量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)tc能被(bei)人體(ti)和(he)動物吸收(shou)并實(shi)際利(li)用，大部分tc會隨其代謝物釋放到環境中。此外，過(guo)(guo)度使用tc會增強(qiang)抗生(sheng)素(su)(su)耐(nai)藥菌(jun)和(he)抗生(sheng)素(su)(su)耐(nai)藥基因的(de)(de)(de)(de)(de)(de)傳播，tc殘留(liu)也會在(zai)人體(ti)內積累(lei)，引起胃腸道疾病(bing)、過(guo)(guo)敏(min)、腎(shen)毒性以及(ji)血液或(huo)中樞神經系統(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)不良反應。目前，許多國(guo)家將tc在(zai)肉類和(he)水中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)大殘留(liu)限量規(gui)定為0.1mg?l-1。焦磷酸鹽離子(ppi)是(shi)生(sheng)物系統(tong)中最(zui)重要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)陰離子之一，在(zai)廣(guang)泛的(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)物過(guo)(guo)程中起著至關重要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)作用。活細胞中ppi的(de)(de)(de)(de)(de)(de)缺乏或(huo)過(guo)(guo)量均可導致人類出現(xian)異常。同時，ppi也是(shi)富營養(yang)化(hua)等相關生(sheng)態問(wen)題的(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要致使因子。

2、目前檢(jian)測(ce)tc和ppi的(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)有(you)：電化學法(fa)、分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度(du)法(fa)、免(mian)疫分(fen)析法(fa)、毛細管電泳法(fa)和高(gao)效(xiao)液相(xiang)色譜法(fa)等，雖然這些(xie)方(fang)(fang)法(fa)都有(you)各自(zi)的(de)(de)優勢(shi)，但是也存在(zai)一(yi)定的(de)(de)缺陷，比如步驟(zou)繁瑣，耗時費力，儀器裝置復雜昂(ang)貴，檢(jian)測(ce)周期(qi)長，成本(ben)高(gao)，抗干(gan)擾(rao)能力弱以(yi)及準確度(du)低等，限(xian)制(zhi)了上(shang)述檢(jian)測(ce)方(fang)(fang)法(fa)在(zai)實際(ji)中的(de)(de)應(ying)用。熒(ying)光(guang)(guang)法(fa)具(ju)有(you)響應(ying)快、成本(ben)低和靈敏度(du)高(gao)等優點，受到諸多研(yan)究(jiu)者的(de)(de)青睞。因此，亟需發(fa)展一(yi)種快速、高(gao)效(xiao)熒(ying)光(guang)(guang)檢(jian)測(ce)tc和ppi的(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)。

3、碳(tan)量子點(cqds)具(ju)有操作簡單、響應速度(du)快、選(xuan)擇性(xing)好(hao)、對各(ge)種(zhong)分(fen)析物(wu)(wu)的(de)檢(jian)(jian)測(ce)靈敏度(du)高等特(te)點。特(te)別是以生物(wu)(wu)質為前驅體(ti)的(de)綠色cqds，不僅(jin)兼備可(ke)持續性(xing)、低成本(ben)、生物(wu)(wu)相容性(xing)、易于(yu)使用(yong)(yong)等優點，而且對人(ren)體(ti)毒性(xing)低。因此，綠色cqds已廣泛應用(yong)(yong)于(yu)構(gou)建各(ge)種(zhong)熒光探針，可(ke)用(yong)(yong)于(yu)檢(jian)(jian)測(ce)金屬離子、氨基酸、藥物(wu)(wu)和環境污染物(wu)(wu)等各(ge)種(zhong)目標分(fen)析物(wu)(wu)。然而，目前開發的(de)綠色前驅體(ti)cqds主要(yao)用(yong)(yong)于(yu)光傳感(gan)中(zhong)單個(ge)(ge)目標的(de)檢(jian)(jian)測(ce)。若能利(li)用(yong)(yong)單一cqds傳感(gan)平臺實現(xian)對兩(liang)個(ge)(ge)或多個(ge)(ge)目標的(de)檢(jian)(jian)測(ce)，則有助于(yu)提高分(fen)析效率，減少資源消耗。

4、此外，聚合酶鏈式(shi)反應(ying)(polymerase?chain?reaction，pcr)是一(yi)種(zhong)在體外擴(kuo)增(zeng)(zeng)dna片段的(de)重要技術，廣泛應(ying)用(yong)于生物(wu)學(xue)研(yan)究和臨床診斷領(ling)域。科(ke)學(xue)家們通(tong)常使用(yong)實時熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)pcr(real-time?fluorescence?pcr)方法對(dui)pcr擴(kuo)增(zeng)(zeng)產物(wu)進(jin)行監測，即使用(yong)能夠結合雙鏈dna的(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)染料(liao)(如sybr?green)來實時監測pcr反應(ying)中dna的(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)情況。然而，傳(chuan)統的(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)染料(liao)存(cun)在價(jia)格高(gao)、信噪比低、自發熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)高(gao)以及熒(ying)(ying)光(guang)(guang)(guang)穩定性差等問題。

技術實現思路

1、本發(fa)明的(de)(de)目(mu)的(de)(de)在(zai)于提供(gong)一種熒光(guang)探針的(de)(de)制(zhi)備方法及其在(zai)檢(jian)測四環(huan)素、焦磷酸鹽離子中的(de)(de)應用，能夠同時檢(jian)測四環(huan)素和(he)焦磷酸鹽離子；

2、為達到(dao)上述目的，本發(fa)明采用的技術方案是：

3、一種熒(ying)光探(tan)針的制備方法，包括如下步驟：

4、將馬齒莧(xian)粉(fen)末加(jia)入乙醇(chun)中(zhong)(zhong)混合均(jun)勻后，進行(xing)加(jia)熱反應，之后冷卻至(zhi)室溫，得到(dao)懸浮液(ye)(ye)；將懸浮液(ye)(ye)離心或過濾去除不溶物(wu)，得到(dao)均(jun)相溶液(ye)(ye)；將均(jun)相溶液(ye)(ye)在水(shui)浴中(zhong)(zhong)旋轉(zhuan)蒸發(fa)，將均(jun)相溶液(ye)(ye)在水(shui)浴中(zhong)(zhong)旋轉(zhuan)蒸發(fa)，得到(dao)溶質；將溶質溶解于超純水(shui)中(zhong)(zhong)，冷凍干燥得到(dao)碳(tan)量子點熒光(guang)探針粉(fen)末。

5、優選地，所述馬齒莧粉末和乙(yi)醇的比例(li)為(wei)：0.2g：9～11ml。

6、優選地，所述加(jia)熱(re)反應溫度為(wei)190～210℃，反應的(de)時間為(wei)9.5～10.5h。

7、本發明另一方(fang)面，提供根據上述(shu)所述(shu)的制(zhi)備(bei)方(fang)法制(zhi)得(de)的熒(ying)光(guang)探針。

8、本發明另一方面，提供(gong)上(shang)述(shu)所述(shu)的熒(ying)光探針在檢測四環素和焦磷(lin)酸鹽(yan)離子中的應用。

9、本(ben)發(fa)明另一(yi)方(fang)面(mian)，提供利用上(shang)述所述的(de)熒光探針檢測四環素的(de)方(fang)法，包(bao)括如(ru)下步驟：

10、(1)將熒光探針加入超(chao)純(chun)水，超(chao)聲使其充分溶(rong)解，得到cqds儲備液(ye)；

11、(2)將四(si)環素粉(fen)末加入到無(wu)水(shui)乙醇，超聲(sheng)使其充分溶解得到四(si)環素儲(chu)備液(ye)；

12、(3)將cqds儲(chu)備液(ye)和超純水混(hun)合后，得(de)到稀(xi)(xi)釋液(ye)，在(zai)(zai)331nm的激發下，記錄在(zai)(zai)402nm處的熒(ying)光(guang)值(zhi)為f0，之(zhi)后在(zai)(zai)稀(xi)(xi)釋液(ye)中(zhong)加(jia)入(ru)不(bu)同體積的四環(huan)素(su)儲(chu)備液(ye)，得(de)到混(hun)合液(ye)，記錄混(hun)合液(ye)的熒(ying)光(guang)值(zhi)f，通過線性(xing)(xing)擬(ni)合，得(de)到四環(huan)素(su)濃度(du)與cqds熒(ying)光(guang)強度(du)的線性(xing)(xing)關系，建立第一線性(xing)(xing)方程；

13、(4)將cqds儲(chu)備(bei)液(ye)和待測樣(yang)(yang)品(pin)混合(he)，通過測量402nm處(chu)熒光強度的(de)變化(hua)，代入第(di)一線性方(fang)程即可得到樣(yang)(yang)品(pin)中四環(huan)素(su)的(de)含(han)量。

14、優選地，所(suo)述(shu)cqds儲備液濃(nong)度(du)(du)為5mg/ml；所(suo)述(shu)稀釋液濃(nong)度(du)(du)為0.0005mg/ml；所(suo)述(shu)四環(huan)素儲備液濃(nong)度(du)(du)為1mm；在線性范(fan)圍(wei)0.5-9μm內，第一線性方程為：f0-f＝451.812log?c(tc)+173.590，r2＝0.9958。

15、本(ben)發明另一方面，提供利用(yong)上述所述的熒(ying)光(guang)探針檢測(ce)焦磷酸鹽離(li)子的方法，包括如下步驟：

16、(1)將熒光探針加入超(chao)純水，超(chao)聲使(shi)其(qi)充分溶解(jie)，得(de)到(dao)cqds儲(chu)備(bei)液(ye)，將cqds儲(chu)備(bei)液(ye)與(yu)fe3+溶液(ye)混合(he)，得(de)到(dao)cqds/fe3+儲(chu)備(bei)液(ye)，

17、(2)將焦(jiao)磷(lin)酸鈉(na)粉末加(jia)入到超純水中(zhong)，漩(xuan)渦(wo)混勻使其充分溶(rong)解(jie)得到ppi儲備液；

18、(3)將cqds/fe3+儲備液(ye)(ye)和超純水(shui)混合(he)(he)后，得到稀釋液(ye)(ye)，在(zai)331nm的激發下(xia)，記錄在(zai)402nm處的熒(ying)(ying)光(guang)值為f0，之(zhi)后在(zai)稀釋液(ye)(ye)中加入不同體積(ji)的ppi儲備液(ye)(ye)，得到混合(he)(he)液(ye)(ye)，記錄混合(he)(he)液(ye)(ye)的熒(ying)(ying)光(guang)值f，通過線(xian)性擬(ni)合(he)(he)，得到ppi濃度與(yu)cqds/fe3+熒(ying)(ying)光(guang)強度的線(xian)性關系(xi)，建立第二線(xian)性方(fang)程；

19、(4)將(jiang)cqds/fe3+儲備液(ye)和待測(ce)樣(yang)品混(hun)合，通過測(ce)量(liang)402nm處(chu)熒光(guang)強(qiang)度的(de)變化，代(dai)入(ru)第二線性方程即(ji)可得到樣(yang)品中ppi的(de)含量(liang)。

20、優選地，所述(shu)cqds儲(chu)備(bei)液濃(nong)度(du)(du)為5mg/ml，fe3+溶(rong)(rong)液濃(nong)度(du)(du)為10mm，cqds/fe3+儲(chu)備(bei)液中cqds儲(chu)備(bei)液和fe3+溶(rong)(rong)液的(de)體積比(bi)為210：200；所述(shu)稀(xi)釋液濃(nong)度(du)(du)為0.0005mg/ml；所述(shu)ppi儲(chu)備(bei)液濃(nong)度(du)(du)為10mm；在線(xian)性范圍(wei)0.5-9μm內，線(xian)性方程(cheng)為：(f-f0)/f0＝171.770log?c(ppi)-113.630，r2＝0.9926。

21、本發(fa)明另一方面，提供(gong)利用上述(shu)所述(shu)的(de)熒(ying)光(guang)探針(zhen)檢驗(yan)結(jie)(jie)核分(fen)枝桿(gan)菌(jun)pcr擴增(zeng)的(de)方法，包括如下(xia)步驟：將熒(ying)光(guang)探針(zhen)加入超純水，超聲使其充分(fen)溶(rong)解，得到cqds儲(chu)備(bei)液(ye)(ye)(ye)，將cqds儲(chu)備(bei)液(ye)(ye)(ye)與fe3+溶(rong)液(ye)(ye)(ye)混合，得到cqds/fe3+儲(chu)備(bei)液(ye)(ye)(ye)，在cqds/fe3+儲(chu)備(bei)液(ye)(ye)(ye)中加入結(jie)(jie)核分(fen)枝桿(gan)菌(jun)pcr擴增(zeng)產物(wu)，進(jin)行(xing)熒(ying)光(guang)檢測。

22、本方法的(de)優點在于(yu)：前驅(qu)體馬齒莧(xian)分(fen)布廣泛、廉價易得，乙醇為普通試劑，容易采購。熒光(guang)探針制備(bei)方法簡(jian)單，可快速、高(gao)效檢測(ce)tc和(he)ppi的(de)含(han)量(liang)，所(suo)制備(bei)的(de)熒光(guang)探針性(xing)能穩(wen)定，抗干擾能力強，準確度(du)和(he)靈敏度(du)高(gao)。

23、與其他(ta)檢(jian)(jian)測(ce)tc和ppi的方(fang)法(fa)相(xiang)比，該(gai)方(fang)法(fa)具有(you)多項優勢(shi)。首先，它快速有(you)效(xiao)(xiao)，操作簡便。其次，該(gai)方(fang)法(fa)的性能(neng)穩定，檢(jian)(jian)測(ce)成本低，同時具有(you)高靈敏度。最重要(yao)的是，該(gai)方(fang)法(fa)實(shi)現了在一(yi)個cqds傳感(gan)平(ping)臺上對兩個目(mu)標的檢(jian)(jian)測(ce)，從而提(ti)高了分析的效(xiao)(xiao)率，減少(shao)了資源的消耗。

24、同(tong)時，相對監測(ce)pcr擴增產(chan)物(wu)的(de)(de)熒(ying)光染料，本(ben)發明制備的(de)(de)碳量子(zi)點作為(wei)一種新(xin)型的(de)(de)熒(ying)光探針，具有更(geng)低(di)的(de)(de)價格、更(geng)好的(de)(de)信噪比(bi)、更(geng)低(di)的(de)(de)自發熒(ying)光水(shui)平以及更(geng)長的(de)(de)熒(ying)光穩(wen)定性，因此(ci)成為(wei)了監測(ce)pcr反應過程的(de)(de)理(li)想選擇(ze)之一。