熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針及其制備方法
【專利摘要】熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針及其制備方法，涉及一種熒光檢測方法。在容器中按質量比加入1份7-二乙胺基-4-甲基香豆素，以20～60份重蒸苯溶解；再加入1～3份Lawesson’s?reagent，反應物在氮氣氛下攪拌加熱回流反應4～6h；冷卻至室溫，旋轉蒸發抽干有機溶劑；再加入10～20份乙酸乙脂，攪拌5～10min使反應過量的Lawession試劑析出（白色固體），傾出溶液，減壓除去溶劑；反復操作3次；產物在真空干燥器放置48h以上，得黃色純固體產物熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針。
【專利說明】熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種熒光檢測方法，尤其是涉及一種將硫代香豆素作為熒光探針應用于檢測細胞內產生的活性氧物種次氯酸(HC10)的熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針及其制備方法。
【背景技術】
[0002]活性氧是生物體產生的一系列化學性質活潑、氧化能力強的含氧物質的總稱。活性氧不僅包括一些自由基，如羥自由基(.0Η)、超氧陰離子(02_.)、過氧自由基(R00.)等，也包括一些非自由基，如過氧化氫(Η202)、單線態氧C02)和次氯酸(H0C1)等。 [0003]與其他的活性氧物種不同，HC10在人們的日常生活中隨處可見。例如，次氯酸鈉在160多年前便被人們用作消毒劑的主要有效成分。而生物體內源性HC10由髓過氧化物酶(ΜΡ0)介導產生，是一種重要的功能強大的氧化劑，在生理狀態下發揮抗微生物效應，起到保護機體的作用。最近的研究表明，HC10還是天然的適應性免疫佐劑。然而，在特定條件下，假如ΜΡ0催化反應所產生的HC10過量，超過局部抗氧化劑的防御反應時，將導致氧化應激和氧化性組織損傷。已證實，過量HC10引起的氧化應激與白血病、腎炎、小血管炎、腫瘤及動脈粥樣硬化等多種疾病相關，其中，HC10與動脈粥樣硬化疾病的相關性是人們近年來的研究熱點。
[0004]基于HC10在生理、病理過程的重要作用，發展高性能的HC10熒光探針，為進一步研究其在生物學過程中的分子和細胞事件提供探測工具，為疾病的發病機制、診斷及干預的研究提供可靠信息，具有重要意義。
[0005]目前，已報到的次氯酸熒光探針在應用中大都基于單波長發射的熒光信號變化(通常是增強)[J.Am.Chem.Soc., 2007, 129, 7313.；0rg.Lett., 2009, 11, (4),859.；Chem.Biol.，2007, 14，1221.]，這些熒光探針在對細胞內目標物進行定性、定位以及示蹤等方面很好地滿足了人們的要求。然而，隨著研究的深入，人們更希望進一步獲得生物微環境系統中有關目標物的定量信息。
[0006]熒光強度是一個相對的度量單位，要獲得關于被分析物的定量的數據，就需要對在實驗過程中影響熒光強度的各種參素中除被分析物的濃度以外的其它參數進行校正。在桌面實驗的熒光的測試中，上述問題可以簡單地通過已計量好的標準樣建立的標準工作曲線來進行校正而加以解決。但是對于單細胞內的微系統檢測而言，通常的單發射波長探針卻是無法實現的。例如，我們無法知道探針分子在不同細胞中的具體分布，又如，影響探針熒光強度的其它因素，如隨著照射時間產生的光致變性和光漂白等，存在差異性。因而需要在每個測量點上均建立一個標準函數，而這是很難做到的。顯然，通常的單波長發射的熒光探針僅依賴于一個信息通道內的熒光強度的變化，很難在微環境中實現準確的定量測量。
[0007]因此，如果我們要得到細胞微環境中被分析物的定量信息，就需要建立另外一套方法，也就是讓每個探針在分子水平上建立內部的標尺，使之都具有自動校準功能。這意味著需要在原有的發射波長信號通道(λ?)以外，引入第二個發射波長信號通道(λ2)，通過雙波長熒光信號的比值的測量，則能夠減少或消除若干因素的變化對熒光強度測量的影響，包括探針濃度、激發光的光路長度、激發強度和檢測效率等，以及人工假象包括光漂白、探針滲漏、細胞厚度、探針在細胞內(區室化作用引起)或不同細胞群之間(負載效率差異造成)的不均勻分布等，從而獲得準確定量的信息，該方法稱為熒光比率法。
[0008]迄今為止，涉及HC10的熒光比率探針研究報道甚少[Chem.Eur.J.2009, 15，2305-2309.]。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在于針對已報道的細胞內次氯酸(HC10)熒光探針存在的不足，提供一種高靈敏、高選擇性的熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針及其制備方法。
[0010]所述熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針的結構式為:
[0011]
【權利要求】
1.熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針，其特征在于其結構式為:
2.如權利要求1所述熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針的合成路線如下:
3.如權利要求1所述熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針的制備方法，其特征在于具體步驟如下:在容器中按質量比加入1份7- 二乙胺基-4-甲基香豆素，以20~60份重蒸苯溶解；再加入1~3份Lawesson’ s reagent,反應物在氮氣氛下攪拌加熱回流反應4~6h ;冷卻至室溫，旋轉蒸發抽干有機溶劑；再加入10~20份乙酸乙脂，攪拌5~lOmin使反應過量的Lawession試劑析出(白色固體),傾出溶液,減壓除去溶劑；反復操作3次；產物在真空干燥器放置48h以上，得黃色純固體產物熒光比率法檢測次氯酸的熒光探針。
【文檔編號】C09K11/06GK103740360SQ201410035406
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月25日 優先權日:2014年1月25日
【發明者】鄭洪 , 詹心琪, 孫丹 申請人:廈門大學