一種基于CRISPR?Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體及其應用
【專利摘要】本發明涉及一種基于CRISPR?Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體及其應用，所述的釀酒酵母基因組編輯載體通過將Cas9蛋白表達框和sgRNA scaffold表達框整合在載體中，獲得載體?Cas9?sgRNA scaffold，然后將以ADE1為靶位點設計合成的多條sgRNA片段中的任意一條整合到所述的載體?Cas9?sgRNA scaffold中得到所述的釀酒酵母基因組編輯載體。本發明采用單質粒并單拷貝的載體系統，采用一個質粒同時表達Cas9蛋白和sgRNA scaffold，使得靶基因編輯系統只需一步構件和轉化，操作簡便。
【專利說明】
一種基于CRI SPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體及其 應用
技術領域
[0001]本發明涉及一種基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體及其應用。
【背景技術】
[0002] 隨著人類全基因組測序的完成，生命科學研究進入了一個以揭示基因功能為目的 的后基因組時代，基因組編輯技術成為了重要的研究工具和手段。傳統的基因組編輯技術 利用同源重組機制(homologous recombination)對基因進行定向編輯，可以幫助科研人員 明確基因的功能，傳統的基因組編輯技術是以長片段DNA為靶位點，"定位系統"也必須是長 DNA片段，編輯系統構建復雜且費時，實驗周期長，效率很低、且基因易突變等缺陷。第二代 基因組編輯技術(包括ZFN系統和TALEN系統)在一定程度上解決了編輯系統特異性很低的 問題，但是，依舊沒能解決編輯系統構建繁瑣，費時費力的突出問題。第三代基因組編輯技 術CRISPR-Cas9基因組編輯系統在很大程度上解決了以上問題，相比于之前的基因編輯技 術，CRISPR-Cas9系統有著一些無可比擬的優點。1.靶點多，基因組中平均8個堿基就能找到 一個靶點；2.功能更加豐富，經過不同的改造后可提高編輯效率、及調控基因表達水平； 3.CRISPR-Cas9系統構建步驟簡單、使用方便。因此CRISPR-Cas9技術能夠大大降低實驗難 度，縮短實驗周期，提高效率。
[0003] 隨著生物技術的發展，CRISPR_Cas9系統發展成為能夠對多個物種進行精準基因 組編輯的技術。CRISPR-Cas9系統是來源于細菌和古生菌中的一種由RNA介導的適應性免疫 系統，包括兩部分:有切割雙鏈DNA活性的Cas9蛋白和能與靶點DNA序列結合的sgRNA(20個 核苷酸）<XRISPR-Cas9系統僅需20bp的RNA介導其對靶點的編輯，該系統存在構建簡便快 捷、編輯效率高、實驗周期短等優點，已經成為目前最受熱捧的基因組編輯技術。
[0004] 此外，因 CRISPR_Cas9技術具有簡便性和通用性，其在科研、農業、精準醫療領域展 現了巨大的應用前景，尤其在傳染性疾病、遺傳病(如地中海貧血）、腫瘤以及器官移植等領 域開辟了全新的途徑。
[0005] 哈佛大學研究人員利用CRISPR_Cas9技術一次性敲除豬細胞中62個逆轉錄病毒基 因，掃清豬器官用于人體移植的重大難關。美國研究人員針利用該技術將艾滋病毒從艾滋 病患者的細胞基因組中剔除。中山大學黃軍就應用CRISPR-Cas9對人體胚胎細胞中修改β-地中海貧血的基因進行的研究有望治愈這一疾病。
[0006] 參考文獻
[0007] [l]:D0I:10.1126/science.aadll91
[0008] [2]:D0I:10.1038/srep22555
[0009] [3]:D0I:10.1007/sl3238-015-0153-5
[0010] 但是，現有的CRISPR-Cas9系統由兩個質粒組成，其中一個質粒表達具有切割雙鏈 DNA活性的Cas9蛋白，另一個質粒表達sgRNA scaffold。由于CRISPR-Cas9系統采用的是雙 質粒系統，存在構建困難，且雙質粒易受質粒相容性影響。
[0011] 酵母菌是釀酒和面包等發酵產品制作過程的主要"參與者"，與人類生產和生活息 息相關，廣泛應用于食品、醫藥、化工等領域。釀酒酵母(Saccharomyces.Cerevisiae)在分 子遺傳學方面是最先作為外源基因表達的酵母宿主物的酵母菌具有比較完備的基因表達 調控機制和對表達產物的加工修飾能力。在醫藥領域酵母也具有得天獨厚的優勢，如斯坦 福大學Christina D.Smolke通過導入來自植物、細菌和嚙齒動物的21個基因，成功地在酵 母菌內將糖轉化為嗎啡的前體--蒂巴因（thebaine)，Christina D. Smolke還發現，進一 步調整過的酵母可以產生氫可酮一一一種由蒂巴因化學合成的止痛藥。

【發明內容】

[0012] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種在一個質粒中表達 CRISPR-Cas9系統，減少后續編輯系統構建難度的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組 編輯載體及其應用。
[0013]為解決以上技術問題，本發明采用如下技術方案：
[0014]本發明的一個目的是提供一種基于CRISPR_Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載 體，所述的釀酒酵母基因組編輯載體通過將Cas9蛋白表達框和sgRNA scaffold表達框整合 在載體中，獲得載體-Cas9-sgRNA scaffold，然后將以ADE1為靶位點設計合成的多條sgRNA 片段中的任意一條整合到所述的載體-Cas9-sgRNA scaffold中得到所述的釀酒酵母基因 組編輯載體。
[0015] 具體地，所述的Cas9蛋白表達框包括TEF1啟動子、Cas9蛋白、CYC1終止子。
[0016] 更具體地，所述的Cas9蛋白表達框的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 具體地，所述的sgRNA scaffold表達框包括SNR52啟動子、sgRNA scaffold、SUP4 終止子。
[0018] 更具體地，所述的sgRNA scaffold表達框的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0019] 具體地，所述的多條sgRNA片段的序列分別如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8所示。
[0020] 具體地，所述的載體為pSynoYAC0，其序列如SEQIDN0.9所示。
[0021 ] 具體地，所述的載體_Cas9_sgRNA scaffold的序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0022]本發明的另一個目的是提供一種所述的基于CRISPR_Cas9系統的釀酒酵母基因組 編輯載體的制備方法，其包括如下步驟：
[0023] 步驟（1)、根據已知序列設計并合成Cas9蛋白表達框、sgRNA scaffold表達框和多 條sgRNA片段；
[0024]步驟(2)、將Cas9蛋白表達框重組到經酶切的載體中，獲得載體-Cas9;
[0025] 步驟（3)、將sgRNA scaffold表達框重組到經酶切的載體-Cas9中，獲得載體-Cas9~sgRNA scaffold；
[0026] 步驟（4)、將多條sgRNA片段中的任意一條重組到經酶切的載體-Cas9-sgRNA scaffold中，獲得所述的釀酒酵母基因組編輯載體。
[0027] 本發明中，按照常規基因合成方法合成Cas9蛋白表達框、sgRNA scaffold表達框 和多條sgRNA片段，其中，Cas9蛋白表達框分為每段lkb進行合成。
[0028] 具體地，步驟(2)采用AscI酶切載體;步驟(3)采用Pmel酶切載體-Cas9;步驟(4)采 用Notl酶切載體_Cas9_sgRNA scaffold。
[0029] 具體地，步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)中進行重組的反應溫度為48~52°C，重組反應 時間為50~70min。
[0030] 具體地，步驟(2)將Cas9蛋白表達框重組到經酶切的載體中，然后電轉至Epi300感 受態細胞中進行培養，獲得所述的載體_Cas9。
[0031] 具體地，步驟(3)將sgRNA scaffold表達框重組到經酶切的載體-Cas9中，然后電 轉至Ep i 300感受態細胞中進行培養，獲得所述的載體-Cas9_sgRNA scaffο 1 d。
[0032] 具體地，步驟（4)將多條sgRNA片段中的任意一條重組到經酶切的載體-Cas9_ sgRNA scaffold中，然后電轉至Epi300感受態細胞中進行培養，獲得所述的釀酒酵母基因 組編輯載體。
[0033] 更具體地，步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)中電轉至Epi300感受態細胞中，然后涂布 CmR平板，在36~38°C下進行培養11~12h。
[0034]本發明的第三個目的是提供一種基于CRISPR_Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯系 統的制備方法，其通過將所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體電轉至 電轉化感受態細胞中，然后進行培養得到所述的釀酒酵母基因組編輯系統。
[0035] 具體地，電轉化感受態細胞為VL6-48N電轉化感受態細胞。
[0036] VL6-48N電轉化感受態細胞制備方法：
[0037] 1.取超低溫冰箱中凍存的VL6-48N酵母菌液于YH)平板上稀釋涂布，30°C培養2天， 獲得單菌落；
[0038] 2.挑取單菌落于50mLYro液體培養基中培養過夜；
[0039] 3 ·當菌液生長到0D6QQ在0 · 4-0 · 6時3000rpm離心10min收集菌體；
[0040] 4.0°C預冷的無菌水重懸菌體，3000rpm離心10min;
[0041 ] 5 · 0°C預冷的10 %甘油重懸菌體，3000rpm離心10min;
[0042] 6.重復步驟5;
[0043] 7.1mL10%甘油重懸步驟6菌體，每管200uL菌液，分裝于1.5mL無菌EP管中，即為 VL6-48N電轉感受態。
[0044]本發明的第四個目的是提供一種所述的基于CRISPR_Cas9系統的釀酒酵母基因組 編輯載體在釀酒酵母基因中的應用。
[0045] 由于上述技術方案的實施，本發明與現有技術相比具有如下優點：
[0046] 本發明采用單質粒并單拷貝的載體系統，采用一個質粒同時表達Cas9蛋白和 sgRNA scaffold(能在兩種不同的生物中復制的載體，例如既能在原核生物中復制，又能在 真核生物中復制的載體），使得靶基因編輯系統只需一步構件和轉化，操作簡便。且本發明 構建的質粒為單拷貝，屬于嚴謹性控制。
[0047] 說明書附圖
[0048] 圖 1 為pSynoYACO載體圖；
[0049] 圖2為pSynoYAC〇-Cas9_sgRNA scaffold載體圖。
【具體實施方式】
[0050] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明并不限于以下實施 例。本發明中若無特別說明，原料均可市購獲得，方法為本領域的常規方法。
[0051 ] 實施例1:
[0052] 1、根據已知序列設計以下序列：
[0053] 1)酵母Cas9蛋白表達框（TEFlpromoter-Cas9-CYClte;rminito;r)，包括TEF1 啟動 子，Cas9蛋白，CYC1終止子，序列見SEQ ID N0.1，其中：位于SEQ ID N0.1序列首尾的 CGAACGCCATCGACTTACCAGTATGCTACTTACTAT和CAGCAGGAGCTGGACTCTACTGATGTCTGGACAGC為 Cas9蛋白表達框與pSynoYACO載體同源臂序列；ggcgcgcc和ggcgcgcc為AscI酶切位點序列， GTTTAAAC為Pme頂每切位點。
[0054] 2)sgRNA scaffold表達框（SNR52 promoter+sgRNA ScafTold+SUP4terminito;r) 序列見SEQIDN0.2，其中：位于SEQIDN0.2序列首尾的GGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGC和 gctgctaacaaagcccgaaag為sgRNA Scaffold表達框與pSynoYAC0_Cas9載體同源臂序列， GTTTAAAC為Pme頂每切位點序列。
[0055] 3)以ADE1為靶位點的6條sgRNA片段的引物，序列見SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8。
[0056] ADElsgRNA片段與pSynoYAC〇-Cas9_sgRNA scaffold同源臂序列為
[0057] F：tctccgcagtgaaagataaatgatc(SEQ ID NO.11)
[0058] R:GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQ ID N0.12)。
[0059] 2、根據常規基因合成方法合成步驟1中所有片段。
[0060] 1)PCR 擴增
[0061] 其中Cas9蛋白表達框分為每段lkb進行合成，一輪和二輪反應體系如下表。
[0062] 表1為PCR擴增一輪反應體系，表2為PCR擴增一輪反應程序。
[0063] 表 1
[0064]
[0065]
[0066] 表 2
[0067]
[0068] 一輪反應結束后進行二輪反應。
[0069] 表3為PCR擴增二輪反應體系，表4為PCR擴增二輪反應程序。
[0070] 表 3
[0071]
[0075]經二輪擴增得到的PCR產物進行膠回收。
[0076] 2)平連反應：
[0077] 膠回收片段進行平連反應，反應體系如下表5,其中平連載體為經平末端內切酶酶 切后的PUC載體。
[0078] 表 5
[0079]
[0080] 平連反應程序為22Γ反應30min。
[0081] 3)轉化、涂板
[0082] 將上述反應液冷卻后加入到于冰上融化的感受態細胞中，輕彈管壁數下混勻，冰 浴放置30min。42°C熱激90秒，冰浴2min。加入400~500yL LB培養基，37 °C恢復培養60min。 5000rpm離心5min后棄去上清，沉淀重懸后均勾涂布篩選平板上。于37°C培養12h。
[0083] 4)克隆鑒定
[0084] 用無菌牙簽挑選單菌落于200μ1左右LB培養基中，放入37°C搖床1~2h后，取3μ1菌 液進行菌檢PCR擴增【菌檢引物為77:GATGTGCTGCAAGGCGATTA(SEQ ID Ν0.13)和88: TTATGCTTCCGGCTCGTATG(SEQ ID NO. 14)】，剩余菌液繼續放入搖床。6h后將檢到的菌液送測 2~4個。表6為菌檢反應體系，表7為菌檢反應程序。
[0085] 表 6
[0086]
[0087]
[0088] 表 7
[0089]
[0090] 菌檢反應結束后，點膠驗證PCR產物大小是否正確，培養6h后將檢到的菌液送測2 ~4個，測序引物同樣為77/88。
[0091] 將測序結果與設計序列進行比對，確定正確克隆。
[0092]以正確克隆質粒為模板進行擴增獲得序列正確PCR產物，各PCR片段進行PCR反應 拼接，獲得拼接產物，拼接產物膠回收。
[0093] Cas9蛋白表達框（TEF1 promo ter_Cas9_CYCl termini tor)片段，其與pSynoYACO 載 體AscI酶切位點兩側同源臂為CGAACGCCATCGACTTACCAGTATGCTACTTACTAT(SEQ ID NO. 15) 和GCTGTCCAGACATCAGTAGAGTCCAGCTCCTGCTG(SEQIDN0·16)(其與SEQIDN0·1的同源臂反 向互補），同時也是Cas9蛋白表達框擴增引物。sgRNA scaffold表達框與pSynoYAC0_Cas9載 體同源臂為GGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGC(SEQ ID N0.17)和CTTTCGGGCTTTGTTAGCAGC(SEQ ID NO. 18)(其與SEQ ID NO. 2的同源臂反向互補），同時也是其擴增引物。sgRNA序列兩端為 sgRNA片段與pSynoYAC〇-Cas9_sgRNA scaffold載體NotI酶切位點兩側的同源臂為 tctccgcagtgaaagataaatgatc(SEQIDN0.1lWPGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT(SEQID N0.12)。
[0094] 3、Asc頂每切載體pSyn〇YAC0(SEQ ID N0.9)，采用切膠回收酶切后的載體。
[0095] 4、TEFlpromo ter_Cas9_CYCl termini tor 片段重組經 AscI 酶切的pSynoYACO 載體片 段，50 °C反應lh。反應結束后轉化Epi 300感受態細胞，涂布CmR平板。37 °C培養12h后挑取單 克隆進行菌檢，挑取菌檢大小正確克隆進行送測，測序結果與序列進行比對，獲得 pSynoYAC0-Cas9 正確克隆。
[0096] 5、Pme頂每切pSyn〇YAC0-Cas9載體正確克隆，采用切膠回收酶切后的載體。
[0097] 6、sgRNA scaffold表達框片段重組經Pmel酶切的pSynoYACO載體片段，50°C反應 lh。反應結束后轉化Epi300感受態細胞，涂布CmR平板。37°C培養12h后挑取單克隆進行菌 檢，挑取菌檢大小正確克隆進行送測，測序結果與序列進行比對，獲得pSyn 〇YAC0-Cas9-sgRNA scaffold正確克隆（SEQ ID Ν0· 10)。
[0098] 7、NotI酶切pSynoYAC〇-Cas9_sgRNA scaffold載體正確克隆，采用切膠回收酶切 后的載體。
[0099] 8、sgRNA片段重組經Notl酶切的pSynoYAC0-Cas9-sgRNA scaffold載體片段，50Γ 反應lh。反應結束后轉化Epi 300感受態細胞，涂布CmR平板。37 °C培養12h后挑取單克隆進行 菌檢，挑取菌檢大小正確克隆進行送測，測序結果與序列進行比對，獲得pSyn〇YAC0-Cas9-ADEl-sgRNA scaffold正確克隆。
[0100] 9、制備VL6-48N電轉化感受態細胞：
[0101] (1)取超低溫冰箱中凍存的VL6-48N酵母菌液于YPD平板上稀釋涂布，30°C培養2 天，獲得單菌落；
[0102 ] (2)挑取單菌落于50mLYro液體培養基中培養過夜；
[0103] (3)當菌液生長到0D6QQ在0.4-0.6時3000rpm離心10min收集菌體；
[0104] (4)0°C預冷的無菌水重懸菌體，3000rpm離心10min;
[0105] (5)0°C預冷的10%甘油重懸菌體，3000rpm離心10min;
[0106] (6)重復步驟5;
[0107] (7) lmLIO %甘油重懸步驟6菌體，每管200uL菌液，分裝于1.5mL無菌EP管中，即為 VL6-48N電轉感受態。
[0108] 10、電轉lug pSynoYAC〇-Cas9-ADEl_sgRNA scaffold載體。
[0109] 11、電轉后菌液于含有Yro液體培養基的單管中培養I2h。
[0110] 12、3000rpm，2min離心上述菌液，山梨醇清洗兩次細胞，涂布0 · 06g/L腺嘌呤的組 氨酸缺陷型酵母固體培養基。
[0111] 13、2天后觀察酵母單克隆生長情況，統計紅色克隆比例。
[0112] 14、挑取紅色克隆于單管中進行培養30°C，1天。
[0113] 15、將上述菌液提取基因組。
[0114] 采用 ADE1 擴增引物 CAATTACGAAGACTGAACTGGACGG(SEQ ID N0. 19)和 CTACGTGACAAATCTTCACCCACCAG(SEQ ID NO. 20)擴增提取出的酵母基因組并對PCR產物進行 測序。分析測序結果，計算成功編輯的克隆比例30%。
[0115] 以上對本發明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本 發明的內容并加以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，且本發明不限于上述的實施 例，凡根據本發明的精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體，其特征在于:所述的釀酒 酵母基因組編輯載體通過將Cas9蛋白表達框和sgRNA scaffold表達框整合在載體中，獲得 載體-Cas9-sgRNA scaffold，然后將以ADE1為靶位點設計合成的多條sgRNA片段中的任意 一條整合到所述的載體-Cas9-sgRNA scaffold中得到所述的釀酒酵母基因組編輯載體。2. 根據權利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體，其特征在 于:所述的Cas9蛋白表達框包括TEF1啟動子、Cas9蛋白、CYC1終止子。3. 根據權利要求2所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體，其特征 在于:所述的Cas9蛋白表達框的序列如SEQ ID N0.1所示。4. 根據權利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體，其特征 在于:所述的sgRNA scaffold表達框包括SNR52啟動子、sgRNA scaffold、SUP4終止子。5. 根據權利要求4所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體，其特征在 于:所述的sgRNA scaffold表達框的序列如SEQ ID NO.2所示。6. 根據權利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體，其特征 在于：所述的多條sgRNA片段的序列分別如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8所示。7. 根據權利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體，其特征 在于:所述的載體為pSynoYAC0，其序列如SEQIDN0.9所示。8. -種如權利要求1至7中任一項所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯 載體的制備方法，其特征在于:其包括如下步驟： 步驟（1)、根據已知序列設計并合成Cas9蛋白表達框、sgRNA scaffold表達框和多條 sgRNA片段； 步驟(2)、將Cas9蛋白表達框重組到經酶切的載體中，獲得載體-Cas9; 步驟（3)、將sgRNA scaffold表達框重組到經酶切的載體-Cas9中，獲得載體-Cas9-sgRNA scaffold； 步驟（4)、將多條sgRNA片段中的任意一條重組到經酶切的載體-Cas9-sgRNA scaffold中，獲得所述的釀酒酵母基因組編輯載體。9. 一種基于CRI SPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯系統的制備方法，其特征在于:其 通過將權利要求1至7中任一項所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編輯載體電 轉至電轉化感受態細胞中，然后進行培養得到所述的釀酒酵母基因組編輯系統。10. -種如權利要求1至7中任一項所述的基于CRISPR-Cas9系統的釀酒酵母基因組編 輯載體在釀酒酵母基因中的應用。
【文檔編號】C12N1/18GK106086061SQ201610599571
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月27日 公開號201610599571.0, CN 106086061 A, CN 106086061A, CN 201610599571, CN-A-106086061, CN106086061 A, CN106086061A, CN201610599571, CN201610599571.0
【發明人】季廣建, 鐘云鵬, 蔡曉輝, 李彥敏, 楊平
【申請人】蘇州泓迅生物科技有限公司