一種青蒿wrky類轉錄因子編碼序列及應用
【專利摘要】本發明公開了一種青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列，該編碼序列記為AaGSW1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發明的編碼WRKY類轉錄因子AaGSW1，通過調控青蒿素合成關鍵酶基因的表達，從而提高青蒿素的含量。在非轉基因普通青蒿的葉片中青蒿素含量為9mg/g DW，超表達AaGSW1基因表達的轉基因青蒿的葉片青蒿素含量提高到20mg/g DW。該發明對于為青蒿素的規模化生產提供高產、穩定新藥源具有重要意義。
【專利說明】
一種青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列及應 用。
【背景技術】
[0002] 青蒿（Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素 (artemisinin)是從其地上部分分離的一種含有過氧橋結構的倍半砲內酯化合物，是目前 世界上公認的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低 毒的特點。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法 (ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗 炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能。可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。
[0003] 目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量 非常低，不同種植環境和種植品種中其平均含量在青蒿葉片干重的0.01-1%，使得這種藥 物的大規模商業化生產受到了限制。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大，產量低，成本 高。雖然目前有人成功利用酵母發酵產生青蒿素前體物質青蒿酸，還需將青蒿酸人工化學 半合成至青蒿素，該研究尚處于實驗室研發初級階段。也有人嘗試用組織培養和細胞工程 的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0.1%，在芽中最高也只有 干重的0.16%，而大多數研究在根中沒有檢測到青蒿素。因此利用組織培養及細胞工程來 生產青蒿素的可行性也不高。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種青蒿AaGSWl蛋白編碼序列， 該基因編碼WRKY類轉錄因子(AaGSWl )，它參與調控青蒿腺毛的密度;利用轉基因技術將青 蒿AaGSWl轉錄因子超表達載體轉化青蒿可以有效調控青蒿表皮的腺毛密度，從而提高青蒿 素的含量。青蒿素含量從非轉基因青蒿的9mg/g DW提高到20mg/g DW(圖2)，該發明對于為 青蒿素的規模化生產提供高產、穩定新藥源具有重要意義。
[0005] 本發明是通過以下的技術方案實現的：
[0006] 本發明提供了一種青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列，所述編碼序列記為AaGSWl，所 述AaGSWl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示;其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0007] 本發明還提供了一種多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0008] 本發明還提供了一種重組表達載體，所述重組表達載體包含如SEQ ID NO: 1所示 的核苷酸序列。
[0009] 本發明還提供了一種重組表達轉化體，所述重組表達轉化體包含如SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列。
[0010] 本發明還提供了青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列AaGSWl在提高青蒿素含量中的應 用。
[0011] 進一步地，所述應用包括以下步驟：
[0012] 步驟1、將青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列AaGSWl連于植物表達調控序列上，構建含 所述青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列的植物表達載體；
[0013] 步驟2、將步驟1中的所述植物表達載體轉入農桿菌，將所述農桿菌轉入青蒿；
[0014] 步驟3、通過抗生素篩選，獲得含有所述青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列AaGSWl的轉 化細胞，再生轉基因植株。
[0015] 進一步地，在上述步驟2中，采用凍融法進行轉入。
[0016] 本發明還提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，所述方法包括如下步驟：
[0017]步驟1、對青蒿栽培種WRKY類轉錄因子分析，從青蒿cDNA文庫中克隆得至情蒿WRKY 類轉錄因子AaGSWl;
[0018] 步驟2、將AaGSWl基因可操作性地連接于表達調控序列，形成含所述AaGSWl基因的 植物超表達載體；
[0019] 步驟3、將含所述AaGSWl基因的植物超表達載體轉化根癌農桿菌，獲得具有所述植 物超表達載體的根癌農桿菌菌株；
[0020] 步驟4、利用所述根癌農桿菌菌株轉化青蒿，經潮霉素篩選得到抗性苗，再經PCR檢 測為陽性的植株即為轉基因青蒿苗；
[0021 ]步驟5、對獲得的轉基因青蒿進行腺毛密度分析，獲得腺毛密度顯著提高的轉基因 青蒿，進而獲得青蒿素含量提高的青蒿植株。
[0022] 進一步地，所述根癌農桿菌為EHA105。
[0023]進一步地，步驟4中，所述的經PCR檢測的轉基因青蒿植株是指，分別設計合成 AaGSWl基因的檢測引物，進行DNA擴增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為轉基因青 蒿植株，所述的腺毛密度檢測是指在熒光顯微鏡下，青蒿分泌型腺毛在特定波長下顯示明 亮熒光，經拍照后再統計其數量和密度。
[0024]其中，對獲得的轉基因青蒿中青蒿素含量進行HPLC-ELSD測定。
[0025]本發明從青蒿中克隆AaGSWl基因，構建含AaGSWl基因的植物超表達載體，用根癌 農桿菌介導，采用葉盤法將AaGSWl基因超表達載體轉化青蒿;PCR檢測外源目的基因 AaGSWl 的整合情況，通過熒光顯微鏡觀察和統計腺毛密度，獲得了腺毛密度顯著提高的轉基因青 蒿；高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)測定青蒿中青蒿素含量，表明獲得的青 蒿表皮腺毛密度顯著提高的轉基因青蒿中的青蒿素含量也顯著提高。
[0026]在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在 生產本發明的青蒿AaGSWl蛋白多肽時，可以將青蒿AaGSWl蛋白編碼序列可操作地連于表達 調控序列，從而形成青蒿AaGSWl蛋白表達載體。
[0027]如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影 響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分 泌，那么信號肽（分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA;如果啟動子控制序列的轉 錄，那么它是可操作地連于編碼序列;如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那 么它是可操作地連于編碼序列。一般，"可操作地連于"意味著相鄰，而對于分泌前導序列則 意味著在閱讀框中相鄰。
[0028]以下將結合附圖對本發明作進一步說明，以充分說明本發明的目的、技術特征和 技術效果。
【附圖說明】
[0029] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、 目的和優點將會變得更明顯：
[0030] 圖1示出了本發明較優實施例中定量PCR檢測青蒿中AaGSWl表達量的結果；
[0031]圖2示出了本發明較優實施例中使用HPLC檢測青蒿素含量的結果;*，P〈0.01(T檢 驗)。
【具體實施方式】
[0032]下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0033]下面對本發明的實施例作詳細說明：本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambro〇k等分子克 隆：實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0034] 實施例1、青蒿AaGSWl基因的克隆 [0035] 1.青蒿基因組總RNA的提取
[0036] 取青蒿葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)離心 管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA 質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。
[0037] 2.青蒿AaGSWl基因的克隆
[0038]以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉錄酶的作用下合成cDNA;根據 AaGSWl基因的序列設計基因特異性引物（SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4)，通過PCR從總cDNA 中擴增AaGSWl基因，并測序。
[0039] 通過上述步驟，獲得了青蒿中該轉錄因子的全長編碼序列（SEQ ID NO: 1)并推導 出其蛋白編碼序列（SEQ ID NO:2)，其中，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。
[0040] 實施例2、含AaGSWl基因的植物雙元干擾表達載體的構建
[00411 為研究AaGSWl基因對青蒿分泌性腺毛發育的影響，構建AaGSWl過量表達的超表達 載體PHB-AaGSWl。為了方便表達載體的構建，正向引物中引入了BamHl的酶切位點，反向引 物中引入了Sacl的酶切位點，引物如表1所示；
[0042] 表ΙΡΗΒ-AaGSWl載體構建的PCR引物
[0043]
[0044]本實施例將青蒿AaGSWl基因可操作性地連接于表達調控序列，該載體可用于通過 發育調控策略來調控青蒿中青蒿素的含量。
[0045] 實施例3、根癌農桿菌介導的AaGSWl干擾載體遺傳轉化青蒿獲得轉基因青蒿植株
[0046] 1.含AaGSWl超表達載體的根癌農桿菌工程菌的獲得
[0047] 將實施例2中含AaGSWl的植物雙元超表達載體采用凍融法轉入根癌農桿菌（如 EHA105,為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為 Gambar 1)，并進行PCR驗證。結果表明，含AaGSWl的植物雙元干擾表達載體已成功構建到根 癌農桿菌菌株中。
[0048] 2.根癌農桿菌介導AaGSWl基因轉化青蒿
[0049] 2.1.外植體的預培養
[0050] 青蒿種子用75%乙醇浸泡lmin，再用20%NaC10浸泡20min，無菌水沖洗3-4次，用 無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固體培養基 中，25°C、16h/8h(光亮/黑暗)光照培養，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cm左右后，剪取無 菌苗葉片外植體用于轉化。
[0051] 2.2.農桿菌與外植體的共培養
[0052]將所述的葉片外植體，轉到共培養培養基（1/2MS+AS 100μ mol/L)中，滴加含活化 好的所述含AaGSWl植物雙元超表達載體的根癌農桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌 液充分接觸，28 °C暗培養3d。以滴加在不帶有目的基因的根癌農桿菌的1/2MS液體培養基懸 液的葉片外植體為對照。
[0053] 2.3.抗性再生植株的篩選
[0054]將所述的共培養3d的青蒿外植體轉入到發芽篩選培養基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Hyg 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25°C、16h/8h光照培養，每兩周繼代培養一次，經 過2-3次繼代后即可獲得Hyg抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉入生根培養基 (1/2MS+Cb 125mg/L)上培養至生根，從而獲得Hyg抗性再生青蒿植株。
[0055] 3.轉基因青蒿植株的PCR檢測
[0056]根據目的基因所在表達盒上游的35S啟動子區域和AaGSWl分別設計正向引物設計 和反向引物對目的基因進行檢測。結果表明，利用所設計的PCR特異引物，能擴增出特異DNA 片段。而以非轉化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。
[0057]本實施例將所述的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化青蒿的含AaGSWl 植物雙元超表達載體的根癌農桿菌菌株，利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得經 PCR檢測的轉基因青蒿植株。轉基因青蒿植株的獲得為篩選獲得較高青蒿素含量的青蒿株 系提供了直接素材。
[0058] 實施例4、利用HPLC-ELSD測定轉基因青蒿中青蒿素含量
[0059] 1. HPLC-ELSD條件及系統適用性以及標準溶液的配制
[0060] HPLC:采用water alliance 2695系統，色譜柱為C-18反相硅膠柱 (SymmetryShieldTM C18，5μηι，250 X4· 6mm，Waters)，流動相為甲醇：水，甲醇：水的體積比 為70: 30，柱溫30 °C，流速1. OmL/min，進樣量10yL，靈敏度(AUFS = 1.0)，理論塔板數按青蒿 素峰計算不低于2000。
[00611 ELSD:采用water alliance 2420系統，蒸發光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大 系數(gain)為7,載氣壓力5bar;
[0062]精密稱取青蒿素標準品（Sigma公司）2.0mg用lmL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿 素標準品溶液，保存于-20 °C備用。
[0063]本發明中流動相為甲醇(methanol):水，比例為70 % : 30 %時，青蒿素的保留時間 為5. lmin，峰型良好。理論塔板數按青蒿素計算不低于2000。
[0064] 2.標準曲線的制作
[0065] 將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣2μ1，4μ1，6μ1，8μ1，10μ1記錄圖譜 及色譜參數，分別以峰面積(Υ)對標準品含量(X，yg)進行回歸分析。通過研究，本發明中青 高素在4_20yg范圍內呈現良好的log-log線性關系。青高素對照品的log-log線性回歸方程 為：Y= 1 · 28e+000X+4 · 71e+000，R = 0 · 979546。
[0066] 3.樣品的制備和青蒿素含量的測定
[0067]在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鮮的青蒿葉片，于45°C烘箱中烘至恒重。然后 從烘干的枝條上敲下葉，磨成粉末。稱取約〇. lg干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇， 用40W超聲波處理30min，5000rpm離心10min，取上清用0.22μπι濾膜過濾，即可用于HPLC-ELSD測定青蒿素的含量。
[0068]采用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20μ1，根據峰面積代入線形回歸 方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)，從而計算出青蒿植株 中青蒿素的含量。
[0069]在本發明中轉AaGSWl超表達載體的轉基因植株可顯著提高了青蒿中青蒿素含量。 在非轉化普通青蒿含量為9mg/g DW時，同時期轉AaGSWl超表達載體青蒿中青蒿素的含量平 均達到20mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的2.2倍，如圖2所示，轉AaGSWl超表達青蒿中， 使用HPLC檢測青蒿素，結果為三次重復的平均值，誤差線表示標準差。統計分析用t-test檢 驗(*，Ρ〈0·01)〇
[0070] 本實施例采用HPLC-ELSD法測定了轉基因青蒿中青蒿素含量，采用轉化AaGSWl超 表達載體代謝工程策略發現AaGSWl基因的表達與青蒿素的含量具有明顯的關聯關系，為利 用該基因進行過表達研究進而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的實驗證據。
[0071] 本發明的青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列AaGSWl能夠實現提高植物中青蒿素含量， 將所述編碼序列連于植物表達調控載體上，構建含所述編碼序列的植物表達載體;將表達 載體轉入農桿菌，將農桿菌轉入青蒿;通過抗生素篩選，獲得含有所述編碼序列的轉化細 胞，再生轉基因植株;本發明獲得的轉基因青蒿中青蒿素的含量受到顯著調控，在非轉化普 通青蒿含量為9mg/g DW時，同時期轉AaGSWl超表達載體青蒿中青蒿素的含量平均為20mg/g DW，其含量是非轉化青蒿含量的2.2倍。本發明提供了一個調控青蒿中青蒿素含量的轉錄因 子編碼序列，為利用該編碼序列大規模生產青蒿素打下了堅實的基礎。
[0072] 以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創 造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員 依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術 方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列，其特征在于，所述編碼序列記為AaGSWl，所述 AaGSWl的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。2. -種青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列，其特征在于，所述AaGSWl編碼的氨基酸序列如 SEQIDN0:2**。3. -種多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。4. 一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含如SEQ ID NO: 1所示的核苷 酸序列。5. -種重組表達轉化體，其特征在于，所述重組表達轉化體包含如SEQ ID NO: 1所示的 核苷酸序列。6. 根據權利要求1或2所述的青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列AaGSWl在提高青蒿素含量 中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述應用包括以下步驟： 步驟1、將青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列AaGSWl連于植物表達調控序列上，構建含所述 青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列的植物表達載體； 步驟2、將步驟1中的所述植物表達載體轉入農桿菌，將所述農桿菌轉入青蒿； 步驟3、通過抗生素篩選，獲得含有所述青蒿WRKY類轉錄因子編碼序列AaGSWl的轉化細 胞，再生轉基因植株。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述步驟2中，采用凍融法進行轉入。9. 一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 步驟1、對青蒿栽培種H-ZIP IV類轉錄因子分析，從青蒿cDNA文庫中克隆得到青蒿WRKY 類轉錄因子AaGSWl; 步驟2、將AaGSWl基因可操作性地連接于表達調控序列，形成含所述AaGSWl基因的植物 超表達載體； 步驟3、將含所述AaGSWl基因的植物超表達載體轉化根癌農桿菌，獲得具有所述植物超 表達載體的根癌農桿菌菌株； 步驟4、利用所述根癌農桿菌菌株轉化青蒿，經潮霉素篩選得到抗性苗，再經PCR檢測為 陽性的植株即為轉基因青蒿苗； 步驟5、對獲得的轉基因青蒿進行腺毛密度分析，獲得腺毛密度顯著提高的轉基因青 蒿，進而獲得青蒿素含量提高的青蒿植株。10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述根癌農桿菌為EHA105。
【文檔編號】C07K14/415GK106086039SQ201610727766
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月25日
【發明人】唐克軒, 陳明慧, 顏廷祥, 黎凌, 石璞, 呂宗友
【申請人】上海交通大學