一種人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗體及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區和重鏈可變區，所述的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；且所述的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。本發明還公開了上述全分子IgG抗體的DNA分子、表達載體、宿主細胞和應用。
【專利說明】
一種人鼠嵌合抗MESO的全分子I gG抗體及其應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及生物免疫技術領域，尤其涉及一種人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體， 還涉及上述全分子IgG抗體的DNA分子、表達載體、宿主細胞和應用。
【背景技術】
[0002] 間皮素 （m e s 〇 t h e 1 i η，Μ E S 0 )前體多肽是通過磷脂酰肌醇 (glycophosphatidylinositol，GPI)錨定的一種糖基化的細胞表面蛋白，可以被裂解為 30kDa N端的分泌多肽和40kDa C端多肽仍與細胞表面結合，GPI錨定方式，被命名為間皮素 連接蛋白。Mesothel in在某些腫瘤細胞中高表達，尤其是間皮瘤細胞、胰腺腫瘤細胞和卵巢 癌細胞，而在正常組織表達受限，因此成為腫瘤治療的理想靶標。mesothelin的功能是未知 的，在mesothelin缺陷型小鼠中，沒有明顯的復制，血液異常或是解剖異常。
[0003] 已有實驗證實抗MES0的抗體可以阻止相關腫瘤細胞的增殖及轉移等。所以制備抗 MES0的抗體。

【發明內容】

[0004] 基于【背景技術】存在的技術問題，本發明的目的在于提供一種人鼠嵌合抗MES0的全 分子IgG抗體。
[0005] 本發明的目的又在于提供一種編碼上述人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體的DNA 分子。
[0006] 本發明的目的又在于提供一種含有能編碼上述人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體 的DNA分子表達載體。
[0007] 本發明的目的又在于提供一種被上述的表達載體所轉化的宿主細胞。
[0008] 本發明的目的還在于提供一種編碼人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體的應用。
[0009] 為了實現本發明的目的，發明人通過大量試驗研究，包括:人鼠嵌合Fab噬菌體抗 體庫的篩選，抗MES0特異性抗體的純化，抗MES0全分子抗體I gG的制備、表達及純化，抗MES0 全分子抗體IgG的特性分析;最終獲得了一種人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體，包含輕鏈 可變區和重鏈可變區，
[0010] (1)所述的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，或者是該序列經一個或 多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；
[0011] 且(2)所述的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或者是該序列經一個 或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0012] 優選地，所述的輕鏈可變區的三個抗原互補區⑶R的氨基酸序列為SEQ ID N0.5、 SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重鏈可變區的三個抗原互補區⑶R的氨基酸序列 SSEQIDN0.8，SEQIDN0.^PSEQIDN0.1(^；f*。
[0013] 本發明還提出的一種人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體，包含輕鏈恒定區和重鏈 恒定區，所述的輕鏈恒定區的氨基酸序列為SEQ ID N0.11所示，所述的重鏈恒定區的氨基 酸序列為SEQ ID NO. 12所示。
[0014] 本發明還提出的一種DNA分子，其編碼上述的全分子IgG抗體的重鏈或/和輕鏈。 [0015] 優選地，其編碼輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼重鏈可變區的核 酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0016] 本發明還提出的一種表達載體，包含有上述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相 連的表達調控序列。
[0017] 本發明還提出的一種宿主細胞，被上述的表達載體轉化。
[0018]優選地，該宿主細胞可以是被上述的表達載體轉化的293Freestyle細胞。
[00?9 ]本發明還提出的上述的全分子I gG抗體在制備與MES0相關的腫瘤的診斷試劑或治 療藥物中的用途。
[0020] 本發明通過雜交瘤技術獲得對MES0具有高度親和力的鼠源IgG抗體，并獲取了賦 予所述抗體優異特性的重鏈和輕鏈可變區的氨基酸序列和核苷酸序列，并將所述抗體的重 鏈和輕鏈可變區與含有人IgGl抗體恒定區的表達載體連接，最終獲得了具有特異的抗原結 合性和在細胞學上證明抗體可以抑制腫瘤細胞的增殖。
[0021] 本發明提供了一種具有高特異性、良好親和力的抗MES0的人鼠嵌合單克隆抗體。 MES0在某些腫瘤細胞中高表達，尤其是間皮瘤細胞、胰腺腫瘤細胞和卵巢癌細胞，而在正常 組織表達受限，因此本發明的抗MES0抗體可應用于有關MES0陽性的腫瘤的診斷和治療。本 發明以MES0為靶分子，利用雜交瘤技術制備鼠源抗體，然后利用基因工程技術制備人鼠嵌 合抗體。對制備的人鼠嵌合抗MES0抗體做功能鑒定，顯示該抗體能夠與MES0特異性結合，體 外細胞實驗證實抗體能夠抑制MSE0陽性的腫瘤細胞的增殖。
【附圖說明】
[0022]圖1為本發明實施例1所得純化人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體的SDS-PAGE檢測 結果；其中Μ為蛋白分子量標準品，1為抗MES0抗體，2為細胞培養上清，3為流穿；可見使用 Pro. Α柱純化抗MES0抗體的純度高。
[0023]圖2為本發明實施例1所得抗MES0抗體的酶聯免疫吸附試驗檢測結果，可見抗MES0 抗體與MES0蛋白的結合能力較強。
[0024]圖3為本發明實施例1所得抗MES0抗體的免疫印跡鑒定結果；其中1為抗MES0抗體 與MES0陽性人肺癌細胞NCI-H226;2為抗MES0抗體與MES0陰性的人正常上皮細胞BEAS-2B; 可見抗體與MES0蛋白有特異性結合能力。
[0025]圖4為本發明實施例1所得抗1^50抗體的親和力檢測結果，1(0值為5.561乂1〇4、。 [0026]圖5為本發明實施例1所得抗MES0抗體對MES0陽性人肺癌細胞NCI-H226的殺傷作 用，實驗結果顯示抗體濃度在15ymol/mL時可以使細胞存活率降低至25%，而對正常的肺上 皮細胞沒有影響。
【具體實施方式】
[0027]下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
[0028]實施例1人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體的制備
[0029] 1)用MES0抗原免疫小鼠，通過雜交瘤技術獲得抗MES0的鼠源單克隆抗體，然后通 過PCR擴增測序獲得抗體的可變區序列。
[0030] 2)根據已獲得的抗體的重輕鏈可變區序列，設計引物。
[0031 ] 3)擴增抗MES0抗體重鏈、輕鏈。
[0032] 以上述制備的鼠源IgG為模板，分別以上述涉及的重鏈和輕鏈的上下游引物擴增 全分子人源抗體重鏈、輕鏈基因。
[0033] (l)PCR
[0034] 反應體系如下：
[0035]
[0036]
[0037]反應條件如下：
[0038]
[0039] (2)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下觀察目的條帶，切膠回收。
[0040] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0041 ] 4)雙酶切IgG表達質粒
[0042] IgG表達質粒pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk(購自 Invivogen公司）包含IgGl型 人源的重鏈和輕鏈(Kappa)恒定區堿基編碼序列。
[0043] (1 )pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk 模板載體的雙酶切
[0044] 反應體系如下：
[0045]
[0046] 反應條件為:37 °C酶切過夜。
[0047] (2)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下切膠回收。
[0048] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0049] 5)Infusion PCR重組表達質粒
[0050] 反應體系如下：
[0051]
[0052] 反應條件為：5(TC孵育15min。
[0053]取5yL反應液轉化感受態細菌，鋪于相應抗性的平板上，次日挑克隆送測序。將測 序結果正確的克隆保存菌種并擴大培養，提取質粒。
[0054] 6)抗MES0抗體的表達
[0055] (1)取50yg重組后的重鏈質粒于lmL的Opti-MEM培養基中，取50yg的輕鏈質粒于 lmL的Opti-MEM培養基中，取200yL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培養基中，將上述三種 混合液室溫靜置5min。
[0056] (2)然后將兩個質粒混合液混合均勻后，補加500yL的Opti-MEM培養基混合均勻后 直接加入轉染試劑293Fectin的混合液，混合均勻后靜置20min。期間處理293F細胞，將293F 細胞離心后用293F Expression Medium重懸，然后計數以及用臺盼藍計算細胞活力比，吸 取1.00X108個細胞于培養瓶中，用293F Expression Medium定容為94mL。
[0057] (3)20min結束后將6mL的DNA、293Fectin的復合物加入準備好的293F細胞中。
[0058] (4)將細胞放在搖床培養箱中培養，培養條件8 %⑶2,120rmp，37 °C，6天后收集細 胞上清。
[0059] 7)抗MES0抗體的純化
[0060] 將收集的細胞上清用0.22μπι的濾膜過濾，同時將平衡液和洗脫液過濾膜。用AKATA 純化儀按照Protein Α純化的標準步驟純化，以lmL/min的速度上樣，以1.5mL/min的速度洗 脫。
[0061 ] 結果成功表達并純化抗MES0抗體。將純化抗MES0抗體進行SDS-PAGE檢測，其結果 如圖1所示，由圖1可知純化的抗體純度很高，且用Pro. A柱純化效果較好。
[0062]實施例2抗MES0抗體的功能活性鑒定 [0063] 1)酶聯免疫法
[0064]用包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6 )MES0蛋白至2yg/mL包被ELISA96孔板，每孔 加入100yL，4 °C過夜;PBST (PBS含0.5 % TWeen20) 5 %脫脂牛奶-洗滌緩沖液封閉，37 °C孵育 2h; PBST洗滌5次后，每個孔中加入100yLPA21抗體(2yg/mL起始濃度，14個濃度梯度稀釋)37 °C 2h;以1:4000稀釋的羊抗人二抗lOOyL/孔加入到孔內，37 °C孵育lh;過氧化物酶底物顯色 液100μL7孔，室溫下10分鐘后用2M硫酸中止反應，上機檢測比色采用雙波長450nm/690nm。
[0065] 結果如圖2示所示，由圖2可知:抗MES0抗體能與MES0蛋白起抗原抗體反應。
[0066] 2)ffestern blot
[0067] 將MES0陽性人肺癌細胞NCI-H226和MES0陰性的人正常上皮細胞BEAS-2B，進行 10%SDS-PAGE電泳并電轉到硝酸纖維膜上，將此膜與2yg/mL PA21抗體室溫孵育lh，1:4000 稀釋HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司）和ECL發光試劑盒(美國Pierce公司）曝光于凝膠成像 系統(Bio-Rad公司）。
[0068] 結果如圖3所示，由圖3可知：抗MES0抗體與人肺癌細胞NCI-H226表達的MES0蛋白 有特異性結合。
[0069] 3)親和力檢測
[0070] 根據MES0蛋白的等電點以及按照BiacoreXlOO control soft的protocol優化偶 聯條件，斜率優化選擇醋酸鈉作為偶聯稀釋緩沖液。用此緩沖液稀釋MES0樣品稀釋至25ug/ ml后偶聯到CM5芯片上。預設偶聯水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀釋MES0樣 品，稀釋一系列濃度至0uM、5nM、10nM 20碰、4〇11]\1、8〇11]\1。設置進樣時間為18〇8，解離時間 10min，再生緩沖液用50mMpH2 · 2Gly_HCl。按照BiacoreXlOO control soft的protocol進行 上機測試。
[0071] 親和力檢測結果如圖4所示，KD值為5.561X10-1()M。
[0072] 4)MES0抗體對MES0陽性腫瘤殺傷
[0073] 將被試人肺癌細胞NCI-H226和人正常上皮細胞BEAS-2B培養在含有10%小牛血清 (FBS)和1%抗生素(P/S)的DMEM培養基中，37°C5%二氧化碳條件下培養。待細胞培養良好 后轉種在96微孔細胞培養板上，過夜培養當細胞生長在96微孔細胞培養板上達70 %時，無 菌條件下加入不同劑量的抗體，繼續培養24小時，顯微鏡下觀察細胞死亡情況并照相，然后 加 Cell Titer 96 aqueous nonradioactive cell Proliferation assay(Promega MI)檢 查LDH，計算分析細胞死亡百分數，實驗重復三次。
[0074]抗MES0抗體與肺癌細胞的相互作用結果如圖5所示，由圖5可知:在抗體的作用下， MES0陽性的肺癌細胞，細胞存活率為25 %左右，而對MES0陰性人正常肺上皮細胞沒有殺傷 作用。
[0075] 上述文中Μ為mol/L的含義。
[0076] 以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其 發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其特征在 于， (1)所述的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經一個或多個 氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體； 且（2)所述的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經一個或多 個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。2. 根據權利要求1所述全分子IgG抗體，其特征在于，所述的輕鏈可變區的三個抗原互 補區CDR的氨基酸序列為SEQIDN0.5、SEQIDN0.6和SEQIDN0.7所示 ；所述的重鏈可變 區的三個抗原互補區CDR的氨基酸序列為SEQIDN0.8，SEQIDN0.9和SEQIDN0.10所示。3. -種人鼠嵌合抗MES0的全分子IgG抗體，包含輕鏈恒定區和重鏈恒定區，其特征在 于，所述的輕鏈恒定區的氨基酸序列為SEQ ID NO. 11所示，所述的重鏈恒定區的氨基酸序 列為SEQ ID NO. 12所示。4. 一種DNA分子，其編碼權利要求1-3任一項所述的全分子IgG抗體的重鏈或/和輕鏈。5. 根據權利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其編碼輕鏈可變區的核酸序列為SEQID NO. 1所示，編碼重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO.2所示。6. -種表達載體，包含有權利要求4或5所述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的 表達調控序列。7. -種宿主細胞，被權利要求6所述的表達載體轉化。8. 權利要求1-3任一項所述的全分子IgG抗體在制備與MES0相關的腫瘤的診斷試劑或 治療藥物中的用途。
【文檔編號】C07K16/26GK106084044SQ201610483246
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】馮振卿, 唐奇, 許國貞, 劉振云, 朱進, 蒯興旺, 章明炯
【申請人】安徽未名細胞治療有限公司