一種植物乳桿菌凍干粉及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種植物乳桿菌凍干粉及其制備方法，屬于生物菌制品的生產領域。所述凍干粉包括分離乳清蛋白，山梨醇，菊粉，抗壞血酸鈉和植物乳桿菌，WPI的含量為50g/L～150g/L，山梨醇的含量為20g/L～60g/L，菊粉的含量為20g/L～60g/L，抗壞血酸鈉的含量為10g/L～30g/L。本發明的凍干保護劑較常規保護劑顯著提高了植物乳桿菌的存活率，其制備的植物乳桿菌凍干粉中，植物乳桿菌CCFM 8610、植物乳桿菌CCFM 8661等植物乳桿菌的凍干存活率達到100％。
【專利說明】
-種植物乳桿菌凍干粉及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種植物乳桿菌凍干粉及其制備方法，屬于生物菌制品的生產領域。
【背景技術】
[0002] 植物乳桿菌因其優越的發酵性能和多樣的功能性，得到廣泛的關注，并被深入研 究和開發。目前，植物乳桿菌已被廣泛地應用到營養保健、發酵食品、生物醫藥、飼料、畜牧 養殖等行業中。泡菜直投式發酵劑、乳酸菌片劑、活性乳酸菌飲料等植物乳桿菌制品深受廣 大消費者的喜愛。但是植物乳桿菌對外界環境抗性低，國內生產技術不完善導致菌粉細胞 存活率低，確保植物乳桿菌無損失是提高植物乳桿菌活性制品生產的關鍵技術。
[0003] 菌粉便于儲藏和運輸，并有利于后期產品的加工，乳酸菌的生產多W菌粉的形式 呈現。目前真空冷凍干燥是生產菌粉最有效的干燥技術，其可W很好的保持菌體的生理生 化特性和生物活性。乳酸菌預凍成固體后，水分不經過液相，在真空和低溫條件下直接升 華。但是不加任何保護的菌體直接凍干，必然引起機械損傷，細胞膜的流動性和通透性變 化，動態平衡的破壞，細胞會被殺死。因此，凍干乳酸菌時會添加凍干保護劑提高菌體的存 活率。目前凍干保護劑主要包括蛋白質，有機聚合物(聚薦糖、徑乙基纖維素、菊粉等），糖類 (乳糖、薦糖、海藻糖等)和其他成分(如糖醇、維生素 C、谷氨酸鋼、甘油等）。其中蛋白質或聚 合物能夠在冷凍過程形成無定形結構，可W減少化學損傷。但是不同的蛋白因其性質不同， 保護效果亦不同，篩選保護效果好的蛋白質是提高凍干存活率的先決條件。糖類被認為具 有通過氨鍵替代穩定脂質膜和蛋白的效果，同時也可W通過玻璃化過程形成無定形的非晶 結構。脫脂乳、薦糖和海藻糖因其較好的保護效果，是經常被使用的凍干保護劑。
[0004] 雖然目前廣泛使用的保護劑在凍干乳酸菌時已具有較好效果，但是在凍干植物乳 桿菌時存活率均較低。大量研究也表明不同的菌株需要的保護劑不同，保護劑的使用量也 不同。運與菌株的特異性和菌體的大小有關系。因此一種更有效的保護植物乳桿菌的的保 護劑配方及制備策略是提高植物乳桿菌生產的關鍵技術。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是克服現有保護劑對植物乳桿菌較差的凍干保護效 果，提供一種適合于植物乳桿菌的保護劑配方及制備策略。
[0006] 本發明的第一個目的在于提供一種凍干保護劑，成分包括WPI，山梨醇，菊粉，抗壞 血酸鋼;所述WPI的含量為50g/L~150g/L，山梨醇的含量為20g/L~60g/L，菊粉的含量為 20g/L~60g/L，抗壞血酸鋼的含量為lOg/L~30g/L。
[0007] 在本發明的一種實施方式中，所述的乳酸菌的凍干保護劑的組成為:WPI 60g/L， 山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗壞血酸鋼20g/L。
[000引本發明的第二個目的是提供一種植物乳桿菌凍干粉，是由所述凍干保護劑和植物 乳桿菌活性成分制成。
[0009]在本發明的一種實施方式中，所述乳酸菌包括:植物乳桿菌CCFM 8610,植物乳桿 菌CCFM 8661，植物乳桿菌ATCC 14917中的至少一種。
[0010] 在本發明的一種實施方式中，所述植物乳桿菌CCFM 8610已于2012年5月3日在北 京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中屯、保藏，其保藏號為CGMCC No. 6077，并在申請號為201210046323.5，【公開日】 為2012年12月19日的專利中公開;所述植物乳桿菌CCFM 8661已于2011年11月29日在中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中屯、保藏，其保藏號為CGMCC No. 5494，并 于2012年07月18日在申請號為201210046323.5的專利中公開。
[0011] 本發明的第=個目的是提供所述植物乳桿菌凍干粉的制備方法，包括收集菌體、 配制保護劑、凍干和菌體的收集和保藏。
[0012] 在本發明的一種實施方式中，所述收集菌體是收集培養至對數生長期末期的植物 乳桿菌，離屯、獲得菌泥。
[0013] 在本發明的一種實施方式中，所述配制保護劑是配制成濃度為lOOg/L~300g/L的 WPI溶液，濃度均為80g/L~240g/L的菊粉和山梨醇混合溶液，濃度為40g/L~120g/L的抗壞 血酸溶液，滅菌后將上述保護劑溶液W2:1:1的體積比在無菌環境下混勻，制備成凍干保護 劑。
[0014] 在本發明的一種實施方式中，所述凍干是將收集的植物乳桿菌菌泥與凍干保護劑 溶液充分混勻，預凍、一次干燥，再二次干燥。
[0015] 在本發明的一種實施方式中，所述菌粉的收集和保藏是收集菌粉至無菌真空包裝 袋，然后用真空包裝機進行真空封裝
[0016] 在本發明的一種實施方式中，所述植物乳桿菌凍干粉的制備方法為：
[0017] (1)收集菌體:收集培養至對數生長期末期的乳酸菌，在4°C條件離屯、10~20分鐘， 離屯、條件為3000~8000g。棄上清液，加入無菌水或無菌生理鹽水，震蕩混勻洗涂菌體，然后 在相同的條件下離屯、，得到菌泥。將菌泥置于4°C環境下，用于凍干菌粉的制備。
[0018] (2)配制保護劑:稱取一定質量的WPI，完全溶解于一定量的純化水中，配制成濃度 為lOOg/L~300g/L的WPI溶液，己氏殺菌;然后稱取一定質量的菊粉和山梨醇，配制成兩者 濃度均為80g/L~240g/L的混合溶液，115°C高溫滅菌20分鐘;40g/L~120g/L的抗壞血酸鋼 膜濾除菌;滅菌后將將上述保護劑溶液W2:1:1的體積比在無菌環境下混勻，制成此發明的 凍干保護劑。
[0019] (3)凍干:將收集的植物乳桿菌菌泥與凍干保護劑溶液充分混勻，菌懸液倒入凍干 托盤(或培養皿或西林瓶），液面厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷凍干燥機凍干箱，按照W 下凍干工藝進行真空冷凍干燥：
[0020] (a)預凍:將產品溫度降至4°C，保持30~60分鐘，再降溫至-40°C，保持4~6小時。
[0021] (b) -次干燥:預凍完成后，將冷阱溫度降至-40°CW下，開真空累，在凍干箱壓力 低于200mTorr(26.6Pa)后，W0.3°C/min的升溫速率將產品溫度升至-20°C，保持20~30小 時。
[0022] (C)二次干燥:一次干燥完成后，W凍干機最快升溫速率將產品溫度升至20°C，保 持10~20小時，產品無水分揮發后結束凍干過程。
[0023] (4)菌粉的收集和保藏:凍干結束后，收集菌粉至無菌真空包裝袋，然后用真空包 裝機進行真空封裝;真空包裝后的菌粉可根據需要保存在溫度不超過2(TC的任意環境中， 低溫保藏效果更好。
[0024] 有益效果:本發明的凍干保護劑較常規保護劑能夠顯著提高植物乳桿菌的凍干存 活率，制備的植物乳桿菌凍干粉中，植物乳桿菌的凍干存活率達到100%。
【具體實施方式】
[0025] 實施例1凍干保護劑的制備
[00%]稱取一定質量的WPI，完全溶解于一定量的純化水中，配制成濃度為lOOg/L~ 300g/L的WPI溶液，己氏殺菌；然后稱取一定質量的菊粉和山梨醇，配制成兩者濃度均為 80g/L~240g/L的溶液，115°C高溫滅菌20分鐘;40g/L~120g/L的抗壞血酸鋼膜濾除菌。滅 菌后將各保護劑溶液W2:1:1的體積比在無菌環境下混勻，獲得凍干保護劑。
[0027] 實施例2植物乳桿菌CCFM 8610凍干菌粉的制備
[00%] (1)凍干保護劑組成:WPI 60g/L，山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗壞血酸鋼20g/l;常 規凍干保護劑組成:脫脂乳120g/L，薦糖20g/L，海藻糖20g/L。
[0029] (2川欠集菌體:菌株培養至對數生長期末期后，8000g離屯、，棄上清液，用pH 7.0的 生理鹽水洗涂兩次，最后離屯、棄上清液得到濕菌體。
[0030] (3)凍干:取濕菌體0.5旨，1.0旨，1.5旨，2.0旨分別加入10血本發明保護劑和常規保護 劑，充分混勻后，進行真空冷凍干燥，冷凍干燥步驟為：
[0031] 將收集的植物乳桿菌菌泥與凍干保護劑溶液充分混勻，菌懸液倒入凍干托盤(或 培養皿或西林瓶），液面厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷凍干燥機凍干箱，按照W下凍干 工藝進行真空冷凍干燥：
[0032] a)預凍:將產品溫度降至4°C，保持30~60分鐘，再降溫至-40°C，保持4~6小時。
[0033] b)-次干燥:預凍完成后，將冷阱溫度降至-40°CW下，開真空累，在凍干箱壓力低 于200mTorr(26.6Pa)后，W0.3°C/min的升溫速率將產品溫度升至-20°C，保持20~30小時。
[0034] C)二次干燥:一次干燥完成后，W凍干機最快升溫速率將產品溫度升至20°C，保持 10~20小時，產品無水分揮發后結束凍干過程。
[0035] (4)凍干完成后，凍干菌粉用無菌蒸饋水復溶至凍干前體積，測定活菌濃度，計算 凍干存活率，結果如表1所示。
[0036] 表1植物乳桿菌CCFM 8610在兩種保護劑中的凍干存活率
[nm7l
[0038]凍干完成后，常規保護劑的保護效果顯著低于本發明保護劑，植物乳桿菌CCFM 8610在常規保護劑的中凍干存活率均低于70%，在菌泥比例增加時，存活率更低。而本發明 保護劑顯著提高凍干存活率，菌泥添加量低于1.5g/10mL保護劑時，凍干存活率達到100%， 植物乳桿菌CCFM 8610凍干菌粉的活菌含量達到2.0~4.5 X l〇iic化/g。
[0039] 實施例2植物乳桿菌CCFM 8661凍干菌粉的制備
[0040] (1)凍干保護劑組成:WPI 60g/L，山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗壞血酸鋼20g/l;常 規凍干保護劑組成:脫脂乳120g/L，薦糖20g/L，海藻糖20g/L。
[0041 ] (2川欠集菌體:菌株培養至對數生長期末期后，8000g離屯、，棄上清液，用pH 7.0的 生理鹽水洗涂兩次，最后離屯、棄上清液得到濕菌體。
[0042] (3)凍干:取濕菌體0.5邑，1.0邑，1.5邑，2.0邑分別加入10血本發明保護劑和常規保護 劑，充分混勻后，進行真空冷凍干燥，冷凍干燥步驟為：
[0043] 將收集的植物乳桿菌菌泥與凍干保護劑溶液充分混勻，菌懸液倒入凍干托盤(或 培養皿或西林瓶），液面厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷凍干燥機凍干箱，按照W下凍干 工藝進行真空冷凍干燥：
[0044] a)預凍:將產品溫度降至4°C，保持30~60分鐘，再降溫至-40°C，保持4~6小時。
[0045] b)-次干燥:預凍完成后，將冷阱溫度降至-40°CW下，開真空累，在凍干箱壓力低 于200mTorr(26.6Pa)后，W0.3°C/min的升溫速率將產品溫度升至-20°C，保持20~30小時。
[0046] C)二次干燥:一次干燥完成后，W凍干機最快升溫速率將產品溫度升至20°C，保持 10~20小時，產品無水分揮發后結束凍干過程。
[0047] (4)凍干完成后，凍干菌粉用無菌蒸饋水復溶至凍干前體積，立即測定pH值和活菌 濃度，計算凍干存活率，結果如表2所示。
[004引表2植物乳桿菌CCFM 8661在兩種保護劑中的凍干存活率
[0049]
[0050] 凍干完成后，常規保護劑的保護效果顯著低于本發明保護劑，植物乳桿菌CCFM 8661在常規保護劑的中凍干存活率均低于60%，在菌泥比例增加時，存活率更低。而本發明 保護劑顯著提高凍干存活率，菌泥添加量低于2 . Og/lOmL保護劑時，凍干存活率均可達到 100%，植物乳桿菌CCFM 8661凍干菌粉的活菌含量達到2.0~5.5Xl〇iic化/g。
[0051 ]實施例3植物乳桿菌ATCC 14917凍干菌粉的制備
[0052] (1)本發明的凍干保護劑組成:WPI 60g/L，山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗壞血酸鋼 20g/l;常規凍干保護劑組成:脫脂乳120g/L，薦糖20g/L，海藻糖20g/L。
[0053] (2)菌株培養至對數生長期末期后，8000g離屯、，棄上清液，用抑7.0的生理鹽水洗 涂兩次，最后離屯、棄上清液得到濕菌體。
[0054] (3)凍干:取濕菌體0.5g，1. Og，1.5g，2. Og分別加入lOmL本發明保護劑和常規保護 劑，充分混勻后，進行真空冷凍干燥，冷凍干燥步驟為：
[0055] 將收集的植物乳桿菌菌泥與凍干保護劑溶液充分混勻，菌懸液倒入凍干托盤(或 培養皿或西林瓶），液面厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷凍干燥機凍干箱，按照W下凍干 工藝進行真空冷凍干燥：
[0化6] a)預凍:將產品溫度降至4°C，保持30~60分鐘，再降溫至-40°C，保持4~6小時。
[0057] b)-次干燥:預凍完成后，將冷阱溫度降至-40°CW下，開真空累，在凍干箱壓力低 于200mTorr(26.6Pa)后，W0.3°C/min的升溫速率將產品溫度升至-20°C，保持20~30小時。
[0058] (4)凍干完成后，凍干菌粉用無菌蒸饋水復溶至凍干前體積，測定活菌濃度，計算 凍干存活率，結果如表3所示。
[0059] 表3植物乳桿菌ATCC 14917在兩種保護劑中的凍干存活率
[0060]
[0061] 凍干完成后，常規保護劑的保護效果顯著低于本發明保護劑，植物乳桿菌CCFM 8610在常規保護劑的中凍干存活率均低于70%，在菌泥比例增加時，存活率更低。而本發明 保護劑顯著提高凍干存活率，菌泥添加量為0.1~1.5g/10mL保護劑時，凍干存活率達到 100%，植物乳桿菌CCFM 8610凍干菌粉的活菌含量達到2.0~4.5Xl〇iicfu/g;菌泥添加量 為1.5~3g/mL保護劑時，凍干粉中植物乳桿菌存活率達70% W上。
[0062] 采用組成為乳清分離蛋白WPI 50g/L~150g/L，山梨醇20g/L~60g/L，菊粉20g/L ~60g/L，抗壞血酸鋼lOg/L~30g/L的凍干保護劑按上述方法制備的植物乳桿菌凍干粉凍 干存活率均為70 % W上。
[0063] 雖然本發明已W較佳實施例公開如上，但其并非用W限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該W權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種植物乳桿菌凍干保護劑，其特征在于，成分包括乳清分離蛋白，山梨醇，菊粉，抗 壞血酸鈉;含量分別為乳清分離蛋白WPI 50g/L~150g/L，山梨醇20g//L~60g/L，菊粉20g/L ~60g/L，抗壞血酸鈉10g/L~30g/L。2. 根據權利要求1所述的凍干保護劑，其特征在于，所述的植物乳桿菌凍干保護劑的組 成為:WPI 60g/L，山梨醇40g/L，菊粉40g/L，抗壞血酸鈉20g/L。3. -種植物乳桿菌凍干粉，其特征在于，由權利要求1或2所述凍干保護劑和植物乳桿 菌活性成分制成。4. 根據權利要求3所述的凍干保護劑，其特征在于，含有植物乳桿菌CCFM 8610，植物乳 桿菌CCFM 8661，植物乳桿菌ATCC 14917中的至少一種。5. 權利要求3所述植物乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，包括收集濕菌體、配制 保護劑、凍干和菌體的收集和保藏。6. 根據權利要求3所述植物乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，收集濕菌體是收集 培養至對數生長期末期的植物乳桿菌，離心獲得菌泥。7. 根據權利要求3所述的植物乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，所述配制保護劑 是配制濃度為l〇〇g/L~300g/L的WPI溶液，濃度均為80g/L~240g/L的菊粉和山梨醇混合溶 液，濃度為40 g//L~120g/L的抗壞血酸溶液，滅菌后將上述保護劑溶液以2:1:1的體積比在 無菌環境下混勻，制備成凍干保護劑。8. 根據權利要求3所述的植物乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，所述凍干是將收 集的濕菌體與凍干保護劑溶液以0.1~3g: 10mL的比例充分混勻，預凍，一次干燥，二次干 燥。9. 根據權利要求3所述的植物乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，所述菌體的收集 和保藏是收集菌粉至無菌真空包裝袋，然后用真空包裝機進行真空封裝。10. 根據權利要求3所述的植物乳桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于，具體步驟為： (1) 收集濕菌體：收集培養至對數生長期末期的乳酸菌，在4°C，3000~8000g離心5-lOmin;加入無菌水或無菌生理鹽水洗滌菌體，離心，得到菌泥;將菌泥置于4°C環境下，用于 凍干菌粉的制備； (2) 配制保護劑:稱取WPI，配制成濃度為100g/L~300g/L的WPI溶液;稱取菊粉和山梨 醇，配制成濃度均為80g/L~240g/L的混合溶液;配制40g/L~120g/L的抗壞血酸鈉溶液;將 各保護劑溶液分別滅菌后在無菌環境下混勻，制成凍干保護劑； (3) 凍干:將收集的植物乳桿菌菌泥與凍干保護劑溶液充分混勻，倒入凍干容器，液面 厚度0.5~1.0cm，然后放入真空冷凍干燥機凍干箱，按照以下凍干工藝進行真空冷凍干燥： (a)預凍:將產品溫度降至4°C，保持30~60min，再降溫至-40°C，保持4~6h;(b)-次干燥： 預凍完成后，將冷肼溫度降至_40°C以下，打開真空栗，在凍干箱壓力低于26.6Pa后，以0.3 °C/min的升溫速率將產品溫度升至-20°C，保持20~30h;(c)二次干燥:一次干燥完成后，以 凍干機最快升溫速率將產品溫度升至20°C，保持10~20h，至產品無水分揮發； (4) 菌粉的收集和保藏：凍干結束后，收集菌粉至無菌真空包裝袋，然后用真空包裝機 進行真空封裝;真空包裝后的菌粉可根據需要保存在溫度不超過20°C的任意環境中，低溫 保藏效果更好。
【文檔編號】C12N1/20GK106047709SQ201610666406
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月12日 公開號201610666406.2, CN 106047709 A, CN 106047709A, CN 201610666406, CN-A-106047709, CN106047709 A, CN106047709A, CN201610666406, CN201610666406.2
【發明人】陳衛, 崔樹茂, 翟齊嘯, 趙建新, 田豐偉, 王剛, 張灝
【申請人】江南大學