一種亞硒酸鈉還原細菌的培養馴化方法
【專利摘要】一種亞硒酸鈉還原細菌的培養馴化方法。本發明公開了一種亞硒酸鈉還原細菌的培養馴化方法，包括：篩選亞硒酸鈉還原細菌；利用培養基通過兩步法培養，第一步，以5%的接種量接種，在其中逐步逐量添加重金屬鹽，20?25℃培養，培養3天，至OD600≥2；第二步，按1%的量補充新鮮培養基，在培養體系中逐步逐量添加抗生素，20?25℃繼續培養3天，得到具有雙重廣譜抗性的亞硒酸鈉還原細菌。馴化菌株能使硒污染土壤中的亞硒酸鹽含量從86.21 mg/kg降低至5.1 mg/kg，能使含硒廢水中的硒含量從305 μg/L降低至85 μg/L，并能在這兩種硒污染環境中穩定存活。本發明能有效馴化亞硒酸鈉還原細菌，增強菌株的環境適應能力和存活能力，解決了硒污染環境生物修復過程中菌株適應力和生活力不強的問題。
【專利說明】-種亞砸酸納還原細菌的培養馴化方法
[0001]
技術領域
[0002] 本發明屬于微生物技術領域，特別是提供了一種亞砸酸鋼還原細菌的培養馴化方 法。
[0003]
【背景技術】
[0004] 我國有些地區如湖北恩施和陜西安康則屬于高砸地區，其±壤中砸含量嚴重超標 而導致砸中毒如脫毛、貧血等情況的發生。目前±壤砸污染治理的主要方式是植物修復，但 植物生長周期長，收獲植物難W處理等缺陷。近年來研究發現，許多微生物能夠將±壤中毒 性最強的亞砸酸鋼和砸酸鋼還原為毒性較低的單質納米砸，成為植物不易吸收的狀態，降 低植物的含砸量，是進行砸污染±壤修復的環境友好、成本低廉的方法。另外，在工業生產 如純砸的制備、侶電解著色工藝、靜電復印機用的砸鼓感光元件生產和舊鼓脫膜復鍛等過 程中，都會產生大量含砸廢水。為了消除砸污染，回收砸資源，工業上一般采用離子交換法 達到含砸廢水處理的目的。運種方法耗時費力，成本也較高。而采用微生物還原氧化態砸和 進行含砸廢水治理，方式和設備要求較低，成本低廉，產生的單質砸通常處于胞內或附著于 細胞表面，易于回收處理。
[0005] 利用微生物進行砸污染環境治理的過程中，存在一個突出的問題就是砸污染環境 的條件十分復雜，常常含有多種重金屬離子和多種抗生素，而所采用的微生物對運些重金 屬和抗生素不具備抗性，從而降低了其環境適應能力，使得所采用的微生物在環境中生活 力下降甚至完全不能存活，最終導致砸污染環境的微生物修復效率下降，甚至完全不能進 行修復。目前市場上和文獻中尚沒有克服此類難題的實用技術的公開報道。因此，如在篩選 出亞砸酸鋼還原菌株的基礎上開發出一種培養馴化方法，提高功能菌種在復雜環境中的穩 定性、存活率和除砸能力，則能有效解決修復菌種環境適應力差的問題，有效發揮微生物除 砸優勢和解決砸污染環境微生物修復效率低下的問題。
[0006]

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于提供一種亞砸酸鋼還原細菌的培養馴化方法，該方法培養馴化 的亞砸酸鋼還原菌株使用時環境適應能力強，能有效去除砸污染復雜環境中的亞砸酸鹽。 [000引本發明提供的一種亞砸酸鋼還原細菌的培養馴化方法，包括： 篩選亞砸酸鋼還原細菌； 利用培養基通過兩步法培養，第一步，W5%的接種量接種亞砸酸鋼還原細菌，在其中逐 步逐量添加重金屬鹽，20-25 °C培養，培養3天，至0D600 > 2;第二步，按1%的量補充新鮮培養 基，在培養體系中逐步逐量添加抗生素，20-25°C繼續培養3天，得到具有雙重廣譜抗性的亞 砸酸鋼還原細菌。檢測結果表明，馴化培養后的菌株對多種重金屬和抗生素均有較強的耐 受性和抗性。
[0009] 在兩步法中逐步逐量加入的重金屬鹽離子為Agh、Cd2+、Μ2+、Cu 2+、Fe3+、Pb2+ 、Co2+、Mn2+、Zn2+;逐步逐量加入的抗生素為四環素、氨節青霉素、紅霉素、氯霉素、卡那霉 素、慶大霉素、壯觀霉素。逐步逐量加入的方法為:重金屬鹽每次加入一種，每次加入的量為 0.1-10 mmol/L，直至培養基中含有全部上述9種重金屬離子;抗生素每次加入一種，每次加 入的量為1-2000 yg/mL，直至培養基中含有全部上述巧巾抗生素。
[0010] 亞砸酸鋼還原細菌的篩選方法： W含0.2 mM化2Se〇3的LB平板為分離培養基，將采集的±壤樣品稀釋成1(^1至10-8懸 液，取適宜稀釋度涂布在分離平板上，25°C培養l-15d。挑選能夠還原化2Se〇3產生紅色單質 砸的細菌(初步判斷依據為紅色菌落)作為下一步研究的目標菌。將初篩獲得的細菌重新接 種至含與不含化2Se〇3的LB平板上進一步確定是否具有還原化2Se〇3產生紅色單質砸的能 力，記錄形態并保藏。在0-100 Mm化2Se〇3濃度梯度的LB平板上進行耐砸能力測定，挑選耐 砸能力最強的菌株作為后續研究的目標菌株。在含2 mM化2Se化的LB培養液中進行化2Se〇3 還原能力測定及復篩，經過比較得到還原能力強的菌株。
[0011] 所獲菌株為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡呈桿狀，大小為0.5皿XI皿。在LB培養基 上生長良好，12 h形成淡黃色、圓形、光滑、隆起、邊緣整齊、直徑約為2-3 mm的菌落，為嚴格 好氧菌。
[0012] 本發明在篩選出亞砸酸鋼還原菌株的基礎上，采用兩步法對其進行馴化培養，得 到對多種重金屬和抗生素均有較強的耐受性和抗性的菌株。經在砸污染±壤和含砸廢水中 的試驗表明，3天內，馴化菌株能使±壤中亞砸酸鹽含量從86.21 mg/kg降低至5.1 mg/kg;3 天內，馴化菌株能使含砸廢水中的砸含量從305 yg/L降低至85 yg/L。兩種砸污染環境樣品 經過馴化菌株處理后，均符合國家標準。此外，馴化菌株加入到高砸±壤中24 h后的細菌細 胞數量為1.2 X 106個八±壤，遠遠大于馴化培養前的1.1 X 103個/g±壤;馴化菌株加入到含 砸廢水中24 h后的細菌細胞數量為1.5 X 105個/mL廢水，遠遠大于馴化培養前的1.2X 1〇2 個/mL廢水。本發明具有操作簡單，效率高等特點，解決了修復菌種環境適應力差、存活率低 和砸污染環境微生物修復效率低下的問題，
【具體實施方式】 [001引實施例1: 亞砸酸鋼還原細菌的篩選： W含0.2 mM化2Se03的LB平板為分離培養基，將采集的±壤樣品稀釋成1(^1至10-8懸 液，取適宜稀釋度涂布在分離平板上，25°C培養l-15d。挑選能夠還原化2Se03產生紅色單質 砸的細菌(初步判斷依據為紅色菌落)作為下一步研究的目標菌。將初篩獲得的細菌重新接 種至含與不含化2Se03的LB平板上進一步確定是否具有還原化2Se03產生紅色單質砸的能 力，記錄形態并保藏。在0-100 Mm化2Se03濃度梯度的LB平板上進行耐砸能力測定，挑選耐 砸能力最強的菌株作為后續研究的目標菌株。在含2 mM化2Se化的LB培養液中進行化2Se03 還原能力測定及復篩，經過比較得到還原能力強的菌株。
[0014] 所獲菌株為革蘭氏陰性菌，在顯微鏡呈桿狀，大小為0.5皿XI皿。在LB培養基 上生長良好，12 h形成淡黃色、圓形、光滑、隆起、邊緣整齊、直徑約為2-3 mm的菌落，為嚴格 好氧菌。
[0015] 經測定，篩選出的該菌株沒有重金屬耐受性和抗生素抗性。
[0016] 實施例2: 篩選的出發菌株的馴化培養： 利用培養基通過兩步法馴化培養出發菌株，第一步，W5%的接種量接種，在其中逐步逐 量添加重金屬鹽，20-25 °C培養，培養3天，至0D600 > 2;第二步，按1%的量補充新鮮培養基， 在培養體系中逐步逐量添加抗生素，20-25°C繼續培養3天，得到具有雙重廣譜抗性的亞砸 酸鋼還原細菌。
[0017] 在兩步法中逐步逐量加入的重金屬鹽離子為Agh、Cd2+、Μ2+、Cu2+、Fe 3+、Pb2+ 、Co2+、Mn2+、Zn2+;逐步逐量加入的抗生素為四環素、氨節青霉素、紅霉素、氯霉素、卡那霉 素、慶大霉素、壯觀霉素。逐步逐量加入的方法為:重金屬鹽每次加入一種，每次加入的量為 0.1-10 mmol/L，直至培養基中含有全部上述9種重金屬離子;抗生素每次加入一種，每次加 入的量為1-2000 yg/mL，直至培養基中含有全部上述巧巾抗生素。
[001引實施例3: 馴化培養后菌株的重金屬耐受性和抗生素抗性檢測： 檢測馴化培養后的StaooirOjoAo皿Mas sp. EGS12的重金屬耐受性和抗生素抗性:將 Siaooiro如offlonas sp. EGS12菌株用點接法接種于含有不同濃度不同重金屬和不同濃度 不同抗生素的LB瓊脂平板上，觀察其生長狀態，菌株不生長的濃度為該菌對該重金屬和抗 生素的MIC。檢測結果表明，Siaooiro如offlonas sp. EGS12對多種重金屬和抗生素均有較強 的耐受性和抗性。
[0019] SiaooirOjoAo皿Mas sp. EGS12的重金屬和抗生素抗性
應用實例一： 利用馴化培養后的菌株修復砸污染±壤，檢測其存活數量和修復效率： A. 制備LB平板，劃線活化馴化培養后的菌株，在37Γ下培養24 h; B. 種子液制備，將在活化平板上生長的單菌落接種于LB液體培養基中，在37°C下培養 24 h作為種子培養液； C. 將制備好的種子液按3%的接種量接種于LB液體培養基中，37°C、120 rpm培養4她； D. 采用國標GB 15618-1995檢測±壤樣品中重金屬種類和含量，采用孫奉翠等(2013) 的加速溶劑萃取-固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜(ASE-SPE-HPLC-MS/MS)分析方法檢測 ±壤樣品中抗生素的種類和含量。檢測后表明，采集自湖北省恩施自治州魚塘巧的高砸± 壤中的Cd2+、Ni2+、Pb2+和Co2+超過國家標準，四環素、氨節青霉素、慶大霉素含量均大于50 μ g/kg； E. 取培養好的菌懸液采用噴壺對砸污染±壤進行噴淋，按一定的速度將菌懸液均勻 的噴淋到±壤中。±壤中所有+4價砸大部分能被馴化菌株還原，試驗中采用的±壤為采集 自湖北省恩施自治州魚塘巧的高砸±壤，+4價砸含量為86.21 111肖/1^，±壤干燥粉碎后過20 目篩，裝進一個長5 m，寬2 m，高1.5 m的木質槽中，采用噴淋法對槽中±壤噴淋制備好的菌 懸液(約6.5 X lO^c化/L)，恒溫25°C，噴淋速度為50 mL/min，每天早晚各噴淋1次，每次20 mL，3 (1后±壤+4價砸含量降低到5.1 mg/kg; F. 采用巧光顯微鏡計數法檢測馴化菌株加入到高砸±壤中24 h后的細菌細胞的數量 為1.2 X 106個八±壤，遠遠大于馴化培養前的1.1 X 103個/肖±壤。
[0020]應用實例二： 利用馴化培養后的菌株治理含砸廢水，檢測其存活數量和修復效率： A. 制備LB平板，劃線活化馴化培養后的菌種純培養物，在37Γ下培養24 h; B. 種子液制備，將在活化平板上生長的單菌落接種于LB液體培養基中，在37°C下培養 24 h作為種子培養液； C. 將制備好的種子液按3%的接種量接種于LB液體培養基中，37°C、120 rpm培養4她； D. 采用國標GB 15618-1995檢測含砸廢水樣品中重金屬種類和含量，采用孫奉翠等 (2013)的加速溶劑萃取-固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜(ASE-SPE-HPLC-MS/MS)分析方 法檢測±壤樣品中抗生素的種類和含量。檢測后表明，采集自石化企業煉廠電脫鹽單元廢 水中的4護八(12+、化2+、化2+、口護、(：〇2+、和111 2+均超過國家標準，不含抗生素； E. 將菌懸液W8%的比例加入到含砸廢水中，恒溫振蕩培養。含砸廢水中所有+4價砸均 能被還原，試驗中采用的含砸廢水采集自石化企業煉廠電脫鹽單元廢水，含砸量約為305 μ g/L。將采集到的含砸廢水裝入恒溫水浴振蕩器中，按8%的比例加入培養好馴化菌株菌懸 液，30 °C恒溫振蕩培養，3 d后廢水中砸含量降低至85 yg/L，到達國家排放標準100 yg/l; F. 取加入馴化菌株24 h后的含砸廢水，采用巧光顯微鏡計數法檢測馴化菌株細菌細 胞的數量為1.5 X 105個/mL廢水，遠遠大于馴化培養前的1.2 X 102個/mL廢水。
【主權項】
1. 一種亞硒酸鈉還原細菌的培養馴化方法，包括： 篩選亞硒酸鈉還原細菌； 利用培養基通過兩步法培養，第一步，以5%的接種量接種，在其中逐步逐量添加重金屬 鹽，20-25 °C培養，培養3天，至OD600多2;第二步，按1%的量補充新鮮培養基，在培養體系中逐 步逐量添加抗生素，20-25Γ繼續培養3天，得到具有雙重廣譜抗性的亞硒酸鈉還原細菌。2. 根據權利要求1所述的一種亞硒酸鈉還原細菌的培養馴化方法，其特征在于，以含 0.2 mM Na2Se03的LB平板為分離培養基，將采集的土壤樣品稀釋成ΠΓ1至10- 8懸液，取適宜 稀釋度涂布在分離平板上，25°C培養l-15d;挑選能夠還原Na2Se03產生紅色單質硒的細菌 (初步判斷依據為紅色菌落)作為下一步研究的目標菌;將初篩獲得的細菌重新接種至含與 不含Na2Se〇3的LB平板上進一步確定是否具有還原Na2Se〇3產生紅色單質硒的能力，記錄形 態并保藏;在0-100 Mm Na2Se〇3濃度梯度的LB平板上進行耐硒能力測定，挑選耐硒能力最強 的菌株作為后續研究的目標菌株;在含2 mM Na2Se03的LB培養液中進行Na2Se03還原能力測 定及復篩，經過比較得到還原能力強的菌株。3. 根據權利要求1所述的添加重金屬鹽離子為Ag2+、Cd2+、Ni2+、Cu 2+、Fe3+、Pb2+、Co2 +、Mn2+、Zn2+。4. 根據權利要求1所述的添加抗生素為四環素、氨芐青霉素、紅霉素、氯霉素、卡那霉 素、慶大霉素、壯觀霉素。5. 根據權利要求1所述的逐步逐量加入的方法為:重金屬鹽每次加入一種，每次加入的 量為0.1-10 mmol/L，直至培養基中含有全部上述9種重金屬離子;抗生素每次加入一種，每 次加入的量為1-2000 yg/mL，直至培養基中含有全部上述7種抗生素。
【文檔編號】C12N1/02GK106011046SQ201610618604
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月30日
【發明人】袁志輝, 周海燕, 雍婕, 程益, 肖紅仕, 吳永堯
【申請人】袁志輝, 吳永堯, 湖南農業大學, 周海燕