一個用于區分雙孢蘑菇菌株類型的rapd標記及應用
【專利摘要】本發明提供了一個用于鑒定雙孢蘑菇菌株類型的RAPD標記及其應用，雙孢蘑菇菌株根據農藝性狀不同可分為G型、H型、HG型等不同類型，利用RAPD分子標記對雙孢蘑菇菌株進行PCR擴增，僅G型菌株能擴增出2500bp特異片段。本發明的方法用于特異性地鑒別雙孢蘑菇G型菌株,而不用經過出菇試驗。該方法耗時短，操作簡便，特異性強，可以在雙孢蘑菇雜交育種中快速地鑒定親本菌株的特性，極大地提高了雙孢蘑菇雜交育種的效率。
【專利說明】
一個用于區分雙孢蘑菇菌株類型的RAPD標記及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，更具體涉及一個用于區分雙孢蘑菇菌株類型的RAro標 記及應用。
【背景技術】
[0002] 我國是世界上最大的雙孢蘑菇科研、生產、加工與出口的國家，2015年全國產雙孢 蘑菇鮮品達230多萬噸，占世界年產量的一半以上，產值100多億元人民幣，因此雙孢蘑菇生 產具有顯著的經濟效益、社會效益和生態效益。
[0003] 福建省農業科學院食用菌研究所(本發明人單位)30年來收集世界各地的雙孢蘑 菇種質資源達450多株，保藏量占世界第三位，僅次于美國和法國。根據菌株的栽培農藝特 性，結合酯酶同工酶表型分析，可把這些菌株區分為G型、Η型、HG型等不同類型，其詳細的農 藝特征見下表。在雜交育種中需要選擇不同類型的親本，傳統的篩選手段盲目性強，需要進 行出菇來篩選，工作量巨大。
[0004] RAro (隨機擴增的多態性DNA)技術在生物學許多研究領域已得到廣泛的應用，它 克服了同工酶和RFLP等技術的一些缺點，快速、簡便、靈敏度高、需樣量少。本發明人通過大 量的引物篩選和驗證，找到了一個適用于雙孢蘑菇菌株類型預測的、操作快速簡便的分子 標記。利用該分子標記能在雙孢蘑菇雜交育種中快速地鑒定用作親本的G型菌株，不用出菇 試驗，省時省力，這對雜交育種中縮短育種周期、提高育種效率有著重要的意義。

【發明內容】

[0005] 本發明基于分子標記技術，建立一個用于區分雙孢蘑菇菌株類型的RAro標記及應 用。
[0006] 本發明為一個用于區分雙孢蘑菇菌株類型的RAPD標記及應用，是利用RAPD分子標 記對雙孢蘑菇菌株進行PCR擴增。
[0007] 利用RAPD引物對雙孢蘑菇菌株基因組DNA進行RAPD-PCR，能特異性地擴增出 2500bp的產物，所述RAH)引物的核苷酸序列為:5' -ACAACGCCTC-3'。
[0008] 所述的RAPD-PCR方法按照本發明人文獻[陳美元，廖劍華，李洪榮，郭仲杰，盧政 輝，蔡丹鳳，王澤生.雙孢蘑菇栽培菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J].中國農學通報， 2009，（04):149-156.]，具體條件為：94°(：預變性21^11 ;94°(：變性308,45°(：退火308,72°(：延 伸lmin，擴增42個循環;72°C延伸5min，4°C保存。反應體系為:30 ng模板DNA，30 ng引物， 0.1 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2，l U Taq DNA聚合酶，1XPCR緩沖液，用ddH20將總體 積補至20yL。
[0009] 所述引物與標記條帶在鑒別雙孢蘑菇G型菌株上的應用。
[0010] 本發明的方法用于特異性地鑒別雙孢蘑菇G型菌株，該方法耗時短，操作簡便，特 異性強，無需出菇，省時省力。根據特異性擴增產物2500bp條帶的有無來鑒定菌株類型，具 有該條帶的菌株為G型菌株，沒有該條帶的菌株為非G型菌株。
【附圖說明】
[0011] 圖 1 雙孢蘑菇24個G型菌株的RAPD圖譜，M: LambdaDNA/EcoRI+Hindlll Markers; 1-24:滬8213,8211，閩1號，As376，Asl671，Asl789，As321，As555，T-8205，A，D，滬101，21， 22，175,751，福罐3，福罐10，廈前751，仙游841，滬102-1，黃巖62，浣沙176-4 4810。右邊箭 頭指示特異條帶位置，顯示24個G型菌株均擴增出2500bp特異條帶。
[0012] 圖 2 雙孢蘑菇 24 個非 G 型菌株的 RAPD 圖譜，M: LambdaDNA/EcoRI+Hindlll Markers;25-48:102-2，蘇錫一號，T-03，111-455，111，浣沙 176，浣沙 176-3，245-6，F4，F20， 八86,8132°，02,7001，7601，701，厶 818，臺-1，0072,546,50-1，125，浣沙176-2，日本118。右邊 箭頭指示特異條帶位置，顯示24個非G型菌株均未擴增出2500bp特異條帶。
【具體實施方式】 [0013] 實施例1 1 .Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs購自廈門泰京生物有限公司，RAro引物購 自上海生工生物科技有限公司。所述RAH)引物的核苷酸序列為:5 ' -ACAACGCCTC-3 '。
[0014] 2.雙孢蘑菇DNA提取與電泳 雙孢蘑菇DNA提取與DNA電泳按照文獻[陳美元，廖劍華，王澤生.雙孢蘑菇三種類型菌 株的RAH)擴增研究.食用菌學報，1998，5(4): 6-10.]。
[0015] 3.RAPD-PCR反應體系與條件 RAPD-PCR反應體系與條件按照文獻[陳美元，廖劍華，李洪榮，郭仲杰，盧政輝，蔡丹 鳳，王澤生.雙孢蘑菇栽培菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J].中國農學通報，2009， (04) :149-156.]，反應體系為：30 ng模板DNA，30 ng引物，0.1 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl2，l U Taq DNA聚合酶，1XPCR緩沖液，用ddH20將總體積補至20汕。擴增條件為:94°C預 變性2111丨11 ;94°(：變性3〇8,45°(：退火3〇8,72°(：延伸1111丨11，擴增42個循環；72°(：延伸5111丨11，4 1€ 保存。擴增產物20 uL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，GeneFinder熒光染料染色并拍照。
[0016] 4.結果分析 RAPD-PCR檢測結果如圖1、圖2，1-24號為雙孢蘑菇6型菌株，擴增出約250(^特異性0嫩 條帶，檢出陽性率為100%。25-48號為雙孢蘑菇非G型菌株，均未擴增出2500bp特異性條帶， 檢出陽性率為0%。因此，該標記與雙孢蘑菇G型菌株性狀緊密連鎖。該標記與方法可以非常 方便地對雙孢蘑菇G型或非G型菌株進行區分和鑒定。
[0017]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1. 一個用于區分雙孢蘑菇菌株類型的RAPD標記引物，其特征在于:所述RAPD標記引物 的核苷酸序列為:5' -ACAACGCCTC-3'。2. 利用權利要求1所述的引物區分雙孢蘑菇菌株類型的方法，其特征在于:利用RAH)標 記引物對雙孢蘑菇菌株的基因組DNA進行PCR擴增，G型菌株擴增出2500bp的特異性條帶，而 非G型菌株不會擴增出該特異條帶。3. 如權利要求1所述引物在鑒定雙孢蘑菇G型菌株上的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK105969909SQ201610609738
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月29日
【發明人】陳美元, 廖劍華, 郭仲杰, 李洪榮, 蔡志欣, 盧政輝, 王澤生
【申請人】福建省農業科學院食用菌研究所