缺血性腦卒中的分子診斷標志物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了缺血性腦卒中的分子診斷標志物，具體地該診斷標志物為PPIE，PPIE在缺血性腦卒中患者中表達下調，通過檢測PPIE在受試者體內的表達水平，可以判斷受試者是否患有缺血性腦卒中或者患缺血性腦卒中的概率。本發明提供了一種診斷缺血性腦卒中的產品，使用該產品可以實現缺血性腦卒中的早期診斷，從而降低因診斷不及時而導致的高死亡率。
【專利說明】
缺血性腦卒中的分子診斷標志物
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物技術領域，設及缺血性腦卒中的分子診斷標志物，具體地該標志 物為PPIE。
【背景技術】
[0002] 腦血管病與屯、血管病及腫瘤一起是嚴重危害人類健康的=大疾病之一，其具有高 發病率、高致殘率與高死亡率的特點，同時也與屯、血管病及腫瘤一起是人類=大死亡原因 之一。腦血管病主要是由于腦組織血液循環障礙而導致局部神經功能缺失的神經系統疾 病，可分為急性腦血管病及慢性腦血管病。急性腦血管疾病又常被稱為腦卒中，在美國，每 年約80萬人患有腦卒中類疾病，且發病率隨著年齡的增加而增加，運給其不斷老年化的社 會帶來嚴重的問題。在中國，腦血管病發病率逐年上升，已占據人口致死和致殘原因的第一 位。近幾年流行病學調查結果顯示，我國每年新發腦卒中病例約有200萬。而隨著經濟水平 的快速發展，我國人口老齡化問題的不斷加重，W及不健康的生活方式等眾多因素，使得缺 血性腦血管病發病率逐年增長。
[0003] 腦卒中又可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中。缺血性腦卒中占全部腦卒中發病 率的80%左右，并且其發病率隨年齡的增長而增高。缺血性腦卒中的發生主要是由于腦栓 塞及局部血栓的形成，運可能是由動脈粥樣硬化引起的血管狹窄、血栓栓塞，或者是來源于 屯、臟的栓子隨血流至腦部引起腦栓塞；而各種原因造成的血管損傷、血管炎癥也是重要原 因之一。諸多原因引起腦部血液供應障礙，而造成受損腦組織的不可逆性損害，使得腦組織 缺血、缺氧導致最終壞死，給患者造成一系列的神經功能缺損和障礙。目前按照國際上公認 的最常用分型標準的分類方法，缺血性腦卒中疾病TOAST分型系統，可將缺血性腦卒中分為 5個亞型:大動脈粥樣硬化型、屯、源性栓塞型、小動脈閉塞型及不明原因型。
[0004] 缺血性腦卒中是一種遺傳和環境因素共同作用的復雜性疾病，隨著人類基因組計 劃的完成和分子遺傳學的發展，基因的研究受到廣泛重視，尋找疾病的基因標記物成為當 前研究的熱點。今年來，越來越多研究認為，基因在缺血性腦卒中的發生發展過程中起著重 要的調控作用，因此基因與缺血性腦卒中發病風險的關系也備受關注。

【發明內容】

[0005] 為了彌補現有技術的不足，本發明的目的之一，提供一種缺血性腦卒中的診斷標 志物；
[0006] 本發明的目的之二，提供一種診斷產品，實現缺血性腦卒中的早期診斷。
[0007] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[000引本發明提供了檢測PPIE基因的試劑在制備診斷缺血性腦卒中的產品中的應用。
[0009] 進一步，所述PPIE基因在缺血性腦卒中患者中表達下調。
[0010] 進一步，所述診斷缺血性腦卒中的產品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢 、原位雜交或微陣列忍片診斷缺血性腦卒中的產品。
[0011] 進一步，所述用RT-PCR診斷缺血性腦卒中的產品至少包括一對特異擴增PPIE基因 的引物;所述用實時定量PCR診斷缺血性腦卒中的產品至少包括一對特異擴增PPIE基因的 引物;所述用免疫檢測診斷缺血性腦卒中的產品包括:與PPIE蛋白特異性結合的抗體;所述 用原位雜交診斷缺血性腦卒中的產品包括:與PPIE基因的核酸序列雜交的探針;所述用微 陣列忍片診斷缺血性腦卒中的產品包括:蛋白忍片和基因忍片;其中，蛋白忍片包括與PPIE 蛋白特異性結合的抗體，基因忍片包括與PPIE基因的核酸序列雜交的探針。
[0012] 在本發明的一個【具體實施方式】中，所述用實時定量PCR特異擴增PPIE基因的引物 序列如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0013] 進一步，所述診斷缺血性腦卒中的產品包括忍片和/或試劑盒;其中所述忍片包括 基因忍片、蛋白質忍片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒。
[0014] 本發明提供了一種診斷缺血性腦卒中的產品，所述的產品能夠通過檢測PPIE基因 的表達水平來診斷缺血性腦卒中。
[0015] 進一步，上面所述的產品包括忍片、或試劑盒。其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白 質忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定在固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧 酸探針包括用于檢測PPIE基因轉錄水平的針對PPIE基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質忍片 包括固相載體W及固定在固相載體上的PPIE蛋白的特異性抗體;所述試劑盒包括基因檢測 試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試劑盒包括用于檢測PPIE基因轉錄水平的試 劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括PPIE蛋白的特異性抗體。其中，所述基因忍片可用于檢測 包括PPIE基因在內的多個基因（例如，與缺血性腦卒中相關的多個基因）的表達水平。所述 蛋白質忍片可用于檢測包括PPIE蛋白在內的多個蛋白質(例如與缺血性腦卒中相關的多個 蛋白質）的表達水平。通過將多個與缺血性腦卒中的標志物同時檢測，可大大提高缺血性腦 卒中診斷的準確率。
[0016] 進一步，所述基因檢測試劑盒用于特異性擴增PPIE基因引物對。
[0017] 進一步，所述用于擴增PPIE基因的引物對的序列如SEQ ID NO.3和沈Q ID NO.4所 /J、- O
[0018] 在本發明中，"抗體"覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性 抗體）、及抗體片段、組合抗體等，只要它們展現出期望的生物學活性即可。"單克隆抗體"指 從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同和/或結合相同表位，除 了生產單克隆抗體的過程中可能產生的可能變體外，此類變體一般W極小量存在。此類單 克隆抗體典型的包括包含結合祀物的多膚序列的抗體，其中祀物結合多膚序列是通過包括 從眾多多膚序列中選擇單一祀物結合多膚序列在內的過程得到的。
[0019] 單克隆抗體還包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種 或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另 一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，W及此類抗體的片 段，只要它們展現出期望的生物學活性即可。
[0020] "抗體或抗體片段"指無論自天然生成抗體的任何物種衍生，還是通過重組DNA技 術創建;無論自血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母或細菌分離的抗體(例如IgG、IgM、IgA、 1神或1旨6)或片段(諸如化13少(曰13'）2少￥、二硫化物連接的。￥、3。。￥、閉合構象多特異性抗 體、二硫化物連接的scFv、雙抗體）。
[0021] 在本發明中，術語"探針"指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結合的 分子。除非另有指出，術語"探針"通常指能通過互補堿基配對與另一多核巧酸(往往稱為 "祀多核巧酸"）結合的多核巧酸探針。根據雜交條件的嚴謹性，探針能和與該探針缺乏完全 序列互補性的祀多核巧酸結合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式， 包括，但不限于:溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。
[0022] 在本發明中，術語"微陣列"是雜交陣列原件有序排列在基質上，所述雜交陣列原 件諸如聚核巧酸探針(例如寡核巧酸)或結合劑(例如抗體）。所述基質可W是固體基質，例 如，玻璃或二氧化娃玻片、珠、纖維光學粘結劑或半固態基質，例如硝酸纖維素膜。核巧酸序 列可W是DNA、RNA或其中的任何排列。
[0023] 各種探針陣列已經描述在文獻中并且可W用于本發明上下文中檢測可能與本文 所述表型相關的標志物。例如，DNA探針陣列忍片或較大的DNA探針陣列晶片（否則，可W通 過打斷晶片而獲得各個體忍片）用于本發明的一個實施方案。DNA探針陣列晶片一般包含玻 璃晶片，其上放置了高密度DNA探針(短DNA片段)陣列。運些晶片各自可W保持例如約6000 萬個用于識別較長樣品DNA序列（例如，來自個體或群體，例如，包含所關注的標志物）的DNA 探針。用玻璃晶片上的DNA探針組識別樣品DNA通過DNA雜交進行。當DNA樣品與DNA探針陣列 雜交時，樣品結合于樣品DNA序列互補的那些探針。通過評價個體樣品DNA與那些探針更穩 固地雜交，有可能確定已知的核酸序列是否存在于樣品中，由此確定核酸中發現的標志物 是否存在。還可W使用運一手段通過控制雜交條件W允許區別單一核巧酸，例如，用于SNP 鑒定和一種或多種SNP的樣品基因分型來進行ASH。陣列提供了一種同時(或串連)檢測多個 多態性標志物的便利性實施方案。
[0024] 上述探針具有與祀點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。運里，所謂"互補"， 只要是雜交即可，可W不是完全互補。運些多核巧酸通常相對于該特定的堿基序列具有 80 % W上、優選90 % W上、更優選95 % W上、特別優選100 %的同源性。運些探針可W是DNA， 也可W是RNA，另外，可W為在其一部分或全部中核巧酸通過?魁、1魁、6魁、6魁^魁等人工 核酸置換得到的多核巧酸。
[0025] 在本發明的上下文中，"PPIE基因"包括人PPIE基因W及人PPIE基因的任何功能等 同物的多核巧酸。PPffi基因包括與目前國際公共核酸序列數據庫GeneBank中PPIE基因（NC_ 000001.11)DNA序列具有70% W上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；在本發明的 具體實施方案中，所述PPIE基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。
[00%]本發明的PPIE基因可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表達PPIE的DNA 片段的載體轉染細胞獲得。所述載體所述載體包括病毒載體、真核表達載體。
[0027]病毒載體可W是任何適當的載體，包括但不限于逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關病毒載體、瘤疹病毒(例如單純瘤疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。 真核表達載體可W是任何適當的表達載體，包括但不限于pCMV-Myc表達載體、PCDNA3.0表 達載體、PCDNA3.1表達載體、祀GFP表達載體、pEF Bos表達載體、pTet表達載體、pTRE表達載 體、或者在公知表達載體的基礎上經改造的載體，比如地in438、pCAMBIA1301等。
[00%]在本發明的上下文中，PPffi基因表達產物包括人PPIE蛋白W及人PPIE蛋白的部分 膚。所述PPIE蛋白的部分膚含有與缺血性腦卒中相關的功能域。
[0029]叩Pffi蛋白"包括PPIE蛋白W及PPIE蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 PPIE蛋白保守性變異蛋白質、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘 導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人PPIE的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質。在本發明 的【具體實施方式】中，所述PPIE蛋白是由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋 白質。
[0030] 通常，已知的是，一個蛋白質中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質的功能。 本領域技術人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或對氨基酸序列的個別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質的改變產生具有相似功能的蛋白質。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領域公知的。
[0031] 在本發明的上下文中，"診斷缺血性腦卒中"既包括判斷受試者是否已經患有缺血 性腦卒中、也包括判斷受試者是否存在患有缺血性腦卒中的風險。
[0032] 本發明的優點和有益效果：
[0033] 本發明首次發現了 PPIE基因表達與缺血性腦卒中的發生發展相關，對于掲示缺血 性腦卒中的發病機理具有重要的意義
[0034] 本發明提供了診斷產品，通過檢測血液中PPIE的表達水平，從而判斷受試者是否 患有缺血性腦卒中、或者判斷受試者是否存在患有缺血性腦卒中的風險，實現早發現早治 療，降低缺血性腦卒中的致殘率或死亡率。
【附圖說明】
[0035] 圖1顯示利用QPCR檢測PPIE基因在缺血性腦卒中患者中的表達情況.
[0036] 具體的實施方式
[0037] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。W下實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0038] 實施例1篩選與缺血性腦卒中相關的基因標志物
[0039] 1、樣品收集
[0040] 各收集10例正常人血液和缺血性腦卒中患者血液樣本，上述所有標本的取得均通 過倫理委員會的同意。
[0041] 2、RNA樣品的制備及質量分析
[0042] 2.1 RNA樣品的制備
[0043] 使用Promega公司的RNA提取試劑盒提取總RNA。具體步驟如下：
[0044] 1)取Iml收集在肝素或邸TA處理過的試管中的全血，放進無菌離屯、管中；
[0045] 2)收集血細胞:300化pm(400g)離屯、5min，小屯、地從樣品頂部吸走上清；
[0046] 3)加Iml血細胞裂解液，小屯、吸放4-5次，重懸沉淀物；
[0047] 4)3000巧 m 離屯、5min;
[0048] 5)重復步驟3)和4)兩次(共=次）；
[0049] 6)避開細胞沉淀物，小屯、吸走幾乎所有上清，只保留10化1上清液;確認一下BME已 經加到RNA裂解液中，然后加17化1 RNA裂解液到細胞中，吸放重懸并裂解細胞；
[(K)加]7)加35化1 RNA稀釋液，顛倒混合3-4次；
[0化1] 8)置于70。(：水浴中3111111;
[0化2] 9)室溫下 13000g 離屯、IOmin;
[0053] 10)將清亮裂解物轉移到一支無菌離屯、管中；
[0054] 11)向澄清裂解液中加入20化1 95 %乙醇，用移液槍吸放3-4次W混合;將此混合 物轉移到離屯、柱裝配體中，13000g離屯、Imin;
[0055] 12)從離屯、柱裝配體上拿下離屯、柱，棄去收集管中的液體，將離屯、柱裝回到收集管 上，確認一下RNA Wash Solution已用乙醇稀釋，加600]il RNA洗涂液于離屯、柱裝配體， 13000g 離屯、Imin;
[0056] 13)棄去收集管中的液體，將離屯、柱裝回到收集管上，將50iil新鮮制備的D化Se解 育混合物直接加到離屯、柱內的膜上；
[0化7] 14)室溫下解育15min，向離屯、柱中加入20化1 DNA酶終止緩沖液（確認已加入乙 醇），13000g離屯、Imin;
[0化引 15)加入60化1 RNA洗涂液（已加入乙醇），13000g，離屯、Imin;
[0化9] 16)清空收集管，向離屯、柱內加入25化1 RNA洗涂液(已加入乙醇），高速離屯、2min;
[0060] 17)將離屯、柱從收集管上轉移到洗脫管上，向膜上加10化1無核酸酶水，將離屯、柱 裝配體放進離屯、機并使洗脫管的蓋子朝外，13000g離屯、Imin，丟棄離屯、柱，蓋好盛有RNA的 洗脫管，存于-70°C。
[0061 ] 2.2 RNA樣品的質量分析(Nano化OP1000分光光度計）
[0062] NanoDroplOOO分光光度計檢測RNA樣品，RNA-seq測序的樣品要求:0D260/0D280為 1?8-2?2d
[0063] 2.3 RNA樣品的質量分析（Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
[0064] 將上述提取的R N A進行瓊脂糖凝膠電泳，A g i I e n t T e C h n O I O g i e S 2100Bioanalyzer檢測RNA樣品質量，觀察28S rRNA和18S rRNA主帶明顯、無降解、RNA完整 性指數合格、濃度達到要求的符合RNA-seq測序CDNA文庫構建的要求，可W用于文庫構建及 測序。
[0(?日]3、高通量轉錄組測序
[0066] 3.1 RNA-seq 讀段定位
[0067] 首先將低質量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用Top化t Vl. 3.1將清潔片段與 UCSC H. sapiens參考基因組化gl9)進行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的預先構建的索引 從Top化t主頁下載，并作為參考基因組，利用Top化t與基因組匹配時，允許每個讀段(默認 到20)有多個匹配位點，最多2次錯配。Top化t根據外顯子區域和GT-AG剪切信號建立可能的 剪切位點庫，根據運些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用 Top化t方法的系統默認參數。
[006引3.2轉錄豐度評估
[0069]匹配上的讀段文件通過Cufflinks vl.0.3處理，Qifflinks vl.0.3將RNA-seq片 段數目進行標準化計算轉錄本的相對豐度。FPKM值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定 基因化b長的外顯子區域的片段數目。通過貝葉斯推理方法計算FPKM估計值的置信區間。 Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數據庫下載（Homo_ sapiens.GRQi37.63.gtf)。
[0070] 3.3差異表達基因的檢測
[0071 ] 將下載的Ensembl GTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉錄本的表達豐度，檢測差異表 達。在化ffi壯巧俞出中只有q值<0.01，測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。
[007^ 4、結果
[0073] RNA-seq結果顯示，PPIE基因在缺血性腦卒中患者血液中的表達量顯著低于正常 人的表達量。
[0074] 實施例2 QPCR測序驗證PPIE基因的差異表達
[0075] 1、根據高通量測序的檢測結果選擇PPIE基因進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1 中的樣本收集方式選擇缺血性腦卒中患者血液和正常人血液各80例。
[0076] 2、1?^4提取步驟同實施例1。
[0077] 3、逆轉錄:使用TAKARA公司的反轉錄試劑盒進行操作。具體步驟如下：
[0078] (1)取總RNA 2iig進行逆轉錄，加入Oligo(dT)，充分混勻；70°C水浴;5min后立 即冰浴2-3min;
[0079] (2)構建反應體系，其中包括5X逆轉錄緩沖液扣l，dNTP(2.5mM)扣l，RNasin 40UAU ,M-MLV 200UAU，補無核酶水至;
[0080] (3) 42 °C 水浴 60min 后，95 °C 水浴 5min W 滅活 M-MLV;
[0081 ] (4)-20°C 儲存備用。
[0082] 4、QPCR 擴增
[0083] (1)引物設計
[0084] 根據Genebank中PPIE基因和GAPDH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物，由上海生 工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下：
[00化]PPIE基因：
[0086] 正向引物為5'-TCACAGATATTCAGATTC-3'（沈Q ID N0.3);
[0087] 反向引物為5'-CCTTCCTTAATTCTCATT-3'（沈Q ID N0.4)。
[0088] GAPDH 基因：
[0089] 正向引物為5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'（SEQ ID N0.5);
[0090] 反向引物為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)。
[0091] (2)按照表1配制PCR反應體系：
[0092] 其中，SYBR Green聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。
[0093] 表1 PCR反應體系
[0094]
[0095]
[0096] (3)PCR反應條件:95°C IOmin，（95°C 15s，60°C60s) X 45個循環。WSY服 Green作為 巧光標記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，A A CT法進行相對定量。
[0097] 5、統計學方法
[0098] 實驗采用3次重復實驗，結果數據都是W平均值±標準差的方式來表示，使用 SPSS13.0統計軟件來進行統計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具有統 計學意義。
[0099] 6、結果
[0100] 結果如圖1所示，與正常人血液相比，PPIE基因在缺血性腦卒中患者血液中的表達 下調，差異具有統計學意義(P<〇. 05)，同RNA-S巧結果一致。
[0101] 上述實施例的說明只是用于理解本發明的方法及其核屯、思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可W對本發明進行若干改進 和修飾，運些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 檢測PPIE基因的試劑在制備診斷缺血性腦卒中的產品中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述PPIE基因在缺血性腦卒中患者中表達 下調。3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述診斷缺血性腦卒中的產品包括:通過 RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或微陣列芯片診斷缺血性腦卒中的產品。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷缺血性腦卒中的 產品至少包括一對特異擴增PPIE基因的引物。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述特異擴增PPIE基因的引物序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。6. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述診斷缺血性腦卒中的產品包括芯片 和/或試劑盒，其中所述芯片包括基因芯片、蛋白質芯片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒 和蛋白免疫檢測試劑盒。7. -種診斷缺血性腦卒中的產品，其特征在于，所述的產品能夠通過檢測PPIE基因來 診斷缺血性腦卒中。8. 根據權利要求7所述的產品，其特征在于，所述產品包括芯片、或試劑盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白質芯片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒。9. 根據權利要求8所述的產品，其特征在于，所述基因檢測試劑盒用于特異性擴增PPIE 基因引物對。10. 根據權利要求9所述的產品，其特征在于，所述用于擴增PPIE基因的引物對的序列 如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。
【文檔編號】G01N33/68GK105925713SQ201610509640
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月1日
【發明人】楊承剛, 邊洋, 宋宏濤
【申請人】北京泱深生物信息技術有限公司