一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法
【專利摘要】本發明公開了一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟：（1）菌種低溫保藏：取真姬菇液體菌種1.5ml，加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，?20℃液體管冷凍保藏；（2）解凍：取凍存種，立即放入35?40℃的水中，搖晃快速解凍，然后轉入GPY固體培養基，25?28℃恒溫培養。本發明保持真姬菇菌種活力高、不退化、操作簡便、價格低廉、設備要求低、占據空間小、易于推廣。
【專利說明】
一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法
[0001 ] 技術領域:
本發明涉及一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，涉及微生物菌種保藏技術領域。
[0002]【背景技術】:
真姬燕^ypsizygus marmoreus ),別名玉蕈、斑玉蕈，屬擔子菌門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬。真姬菇含有人體所需的八種必須氨基酸，且味道鮮美，熱量低，享有“聞則松茸，食則玉蕈”的美譽，是一種營養豐富的食用兼藥用的珍稀食用菌，也是目前進入工廠化生產的重要食用菌之一，具有提高人體免疫力、預防衰老、延長壽命等多種功效，廣受消費者的喜愛，也是一種極具潛力的生產品種。隨著真姬菇科研及工廠化生產規模的日益加大，急需一種應用廣泛、簡便、有效、經濟的真姬菇菌種保藏方法。
[0003]目前常用的菌種保藏方式為液氮超低溫保存、冷凍干燥保存、石蠟油保存、試管斜面傳代保存等。
[0004]液氮超低溫保存、冷凍干燥保存方法雖然效果良好，但其需要良好的設備及技術，投入過高，不適合在企業推廣;石蠟油保存、試管斜面傳代保存方法雖然簡單、廉價，但保存時間短，每隔一段時間就得重新轉管、傳代，這對于遺傳穩定性較高的菌株影響不大，但對于遺傳穩定性較差的菌株則影響很大，會由于保藏時間長及轉接次數過多導致培養基縮水、染菌、菌種退化，而且這兩種方法占用空間體積大，需要配備較多的冷藏設備空間。
[0005]液體管凍存方法操作簡單、占用空間面積小、保藏時間長，但卻并不適用于所有食用菌菌種保藏。許多食用菌菌種冷凍會致死。液體管凍存分為-20°C凍存(普通家用冰箱)和-70°C凍存(超低溫冰箱)兩種。超低溫冰箱凍存效果更好，但設備價格價格昂貴，在企業極少配備;而家用冰箱價格低廉，企業單位普遍配備。所以研究菌種的_20°C液體管冷凍保藏方法，更有推廣價值。
[0006]
【發明內容】
:
本發明的目的在于克服上述已有技術的不足而提供一種保持真姬菇菌種活力高、不退化、操作簡便、價格低廉、設備要求低、占據空間小、易于推廣的真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法。
[0007]本發明的目的可以通過如下措施來達到:一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟:
(1)菌種低溫保藏:取真姬菇液體菌種1.5ml，加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，-20°C液體管冷凍保藏；
(2)解凍:取凍存種，立即放入35-400C的水中，搖晃快速解凍，然后轉入GPY固體培養基，25-28 °C恒溫培養。
[0008]為了進一步實現本發明的目的，其特征在于其包括如下步驟:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養:
無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養基中，GPY液體培養基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養10-12 天；
②保護液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min;
③超凈工作臺內，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種I.5ml ；
④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于-20°C冷凍保藏；
(2)解凍:
①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止；
②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養基上25-28 °(:恒溫培養，觀察測定菌絲生長狀況。
[0009]本發明同已有技術相比可產生如下積極效果:
1.采用-20°C低溫冷凍保藏法，通過加入保護劑低溫進行冷藏。其所需設備條件及操作程序遠遠低于液氮冷藏，只需一臺普通冰箱就可完成。
[0010]2.通過篩選保護液及其濃度后，將保護液與菌種混合，放置于-20°c保存即可，不需要補充液氮，也不用像傳代培養一樣定期活化，保藏方法簡便易行，價格低廉，非常適合應用于普通科研單位及廣大生產單位。
[0011]3.保藏于2ml凍存管中，占用保藏體積小，一個一百平方厘米的凍存盒能裝一百個凍存管。
[0012]4.可以按盒分類，用時取出一管，管理方便。
[0013]5.保存時間2年以上，不需要定期傳代，減少染菌及菌種退化的幾率。
[0014]6.采用1%濃度的黃原膠作為保護液，黃原膠為微生物產生的生物大分子，無毒，易于降解，來源廣泛。具有快速吸水能力，吸收細胞外的水分，增加粘度，使菌液懸浮，減少冰晶的形成，同時使形成的刺狀冰晶尖端變鈍，從而降低細胞外水分低溫形成的冰晶刺破細胞的幾率;降低溶液中電解質濃度，減少溶質損傷;黃原膠是由微生物莢膜產生，對于微生物本身具有保護作用，且其受PH、鹽等條件影響較小。研究表明，黃原膠在溫度升高到120°C時，其粘度僅下降3%，非常適合保藏過程中的高溫滅菌環節。黃原膠來源廣泛，價格便宜，保存效果好。
[0015]7.所用培養基及溫度等培養條件，均為試驗后得出的結果，適合真姬菇菌絲生長。
[0016]【具體實施方式】:下面對本發明的【具體實施方式】作詳細說明:
實施例1:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養:
無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養基中，GPY液體培養基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養10-12 天。
[0017]②保護液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min。
[0018]③超凈工作臺內，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種1.5ml。
[0019]④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于-20°C冷凍保藏。
[0020](2)解凍:
①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止，盡量減少形成的冰晶對細胞的傷害。
[0021]②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養基上25-28°C恒溫培養，觀察測定菌絲生長狀況。
[0022]實施例2:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養:
無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養基中，GPY液體培養基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養10-12 天。
[0023]②保護液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min。
[0024]③超凈工作臺內，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入Iml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種lml。
[0025]④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于_20°C冷凍保藏。
[0026](2)解凍:
①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止，盡量減少形成的冰晶對細胞的傷害。
[0027]②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養基上25-28°C恒溫培養，觀察測定菌絲生長狀況。
[0028]實施例3:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養:
無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養基中，GPY液體培養基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養10-12 天。
[0029]②保護液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min。
[0030]③超凈工作臺內，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入1.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種0.5ml。
[0031]④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于_20°C冷凍保藏。
[0032](2)解凍: ①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止，盡量減少形成的冰晶對細胞的傷害。
[0033]②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養基上25-28°C恒溫培養，觀察測定菌絲生長狀況。
[0034]以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。
【主權項】
1.一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟: (1)菌種低溫保藏:取真姬菇液體菌種1.5ml，加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，-20°C液體管冷凍保藏； (2)解凍:取凍存種，立即放入35-40°C的水中，搖晃快速解凍，然后轉入GPY固體培養基，25-28 °C恒溫培養。2.根據權利要求1所述的一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟: (1)菌種低溫保藏: ①真姬菇液體菌種的培養: 無菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養基中，GPY液體培養基的配方組分以g/L計為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養10-12 天； ②保護液的制備: 制備1%濃度的黃原膠作為保護液:準確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min; ③超凈工作臺內，采用無菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護液，然后加入準備好的真姬菇液體菌種I.5ml ； ④將準備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于-20°C冷凍保藏； (2)解凍: ①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止； ②取0.5ml保藏菌種，無菌操作移至GPY固體培養基上25-28°C恒溫培養，觀察測定菌絲生長狀況。
【文檔編號】C12N1/14GK105925483SQ201610308335
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月11日
【發明人】程顯好, 孫磊, 劉靜, 李維煥
【申請人】魯東大學