一種脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法，涉及生物工程領域。即利用不同磁場強度和脈沖數的脈沖磁場對醋酸菌進行處理，得到產酸量提高的醋酸菌突變株。使其產酸量提高了20%~60%，且遺傳穩定性較好。
【專利說明】
一種脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法
技術領域
[0001]本發明涉及生物工程技術領域，特指采用不同強度和脈沖數的脈沖磁場對醋酸菌進行處理，提高其產酸量。
【背景技術】
[0002]醋酸菌是一類能夠將酒精轉化為醋酸的嚴格好氧的革蘭氏陰性細菌的總稱。食醋釀造中醋酸菌產酸占據了非常重要的地位，提高其產酸量對食醋增產有重大意義。而且隨著現代發酵技術的進步，殺菌力強、儲存及運輸成本低的高濃度的發酵醋逐漸被釀醋加工企業重視。
[0003]為了提高醋酸菌的產酸能力，探索和研究新的醋酸菌種是一個方向，如宋勇強等從甘肅民間地產傳統釀造食醋醋醅中分離出一株高產酸醋酸菌(宋勇強，胡先望，沙芮，等.一株高產酸醋酸菌的分離與鑒定，中國微生態學雜志，2015，27(9): 997-1003.)，但此技術耗時長，并且結果也是無法預測的，其產量不僅受分離菌基因的影響，也受培養條件的強烈影響。此外，優化醋酸菌發酵技術也可以提高醋酸產量，如張衛華等從乙醇濃度、接種量、發酵溫度及轉速等方面對醋酸菌的產酸進行發酵條件的優化(張衛華，汪超，羅軍杰，等.響應面優化醋酸菌發酵條件研究.中國釀造.2012，31(4):48-51.)，雖然優化發酵工藝可以提高醋酸菌的產量，但發酵成本較高。鑒于此，采用脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法，從而達到食醋增產，降低勞動和生產成本的目的。
【發明內容】
[0004]本發明提供不同磁場強度和脈沖數的脈沖磁場處理菌株，使其產酸量提高了20%?60%，且遺傳穩定性較好。
[0005]—種脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法，按照下述步驟進行:將菌株培養至對數生長期，從菌株中取5 mL于離心管中進行脈沖磁場處理，脈沖磁場的磁場強度范圍為4?8T，脈沖數范圍為10?40個。將處理完的菌液作梯度稀釋，稀釋到合適的梯度后取100 yL涂布于平板培養基上，30?35°C培養64?96 h，將培養好的平板取出并進行菌落計數，以出發菌株為對照，計算致死率，選擇致死率為80%以上的平板進行培養。然后在30?35°C，150?180 r/min進行搖瓶培養，培養64?96 h后，即可提高醋酸菌產酸量。
[0006]菌株培養液態培養基(搖瓶培養的培養基)為:葡萄糖10g，酵母粉或酵母浸膏10g，蛋白胨3 gaOOO mL蒸餾水，30 mL無水乙醇，菌株固態培養基(平板培養培養基)是在上述液態培養基的基礎上，加入18 g瓊脂粉和30 mL 0.03%溴甲酚紫。
[0007]本發明所用的出發菌株是任何一種醋酸菌，如中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)、中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)、中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)等保藏的菌種、以及從環境中分離得到的菌種。優選從醋醅中分離得到的任何一種醋酸菌。
[0008]其中脈沖磁場的磁場強度為4?8T，脈沖磁場的脈沖數為10?40個。
[0009]本發明脈沖磁場處理后的菌株經過10代的傳代后，其產酸量保持較穩定。
[0010]脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法簡單經濟、不僅可以增加醋酸產量，而且可以降低勞動和生產成本。
【具體實施方式】
[0011 ]根據本發明所采用的總酸的測定方法為:醋酸菌培養液，4000 r/min離心1min，去掉沉淀，取上層清液適量，用事先標定好的0.1 mol/L的NaOH滴定。根據公式產酸量(g/L) = (V_V0) XCNaOHX60/Vl式中:V為滴定發酵液樣品所消耗的NaOH的體積，mL;
Vo為滴定對照空白培養基消耗的NaOH的體積，mL;
Vi為樣品體積，mL;
CNa0H為標準的NaOH溶液的濃度，mol/L;
為了進一步闡述本發明的技術方案所涉及的材料及方法，給出了以下實施例，但是下述實施例不以任何形式限制本發明的范圍。
[0012]
實施例1
1.培養基的制備
菌株培養液態培養基(搖瓶培養的培養基):葡萄糖10 g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，加入1000 mL蒸饋水，121°C高壓條件下滅菌20 min，加入30 mL無水乙醇。
[0013]菌株固態培養基(平板培養培養基):葡萄糖10g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉18 g，加1000 mL蒸餾水溶解，完全混勻后加入0.03%溴甲酚紫30 mL，121°C高壓條件下滅菌20 min，冷卻后加入30 mL無水乙醇。
[0014]2.磁場脈沖處理
將菌株(Acetobacter，中國工業微生物保藏中心，保藏編號:CICC21684)培養至對數生長期，取5 mL菌液于離心管中進行脈沖磁場處理，磁場強度選用4 T，脈沖數40個。將處理完的菌液作梯度稀釋，稀釋到合適的梯度后取100 yL涂布于平板上，30°C培養64 h，致死率達到85%。
[0015]3.高產醋酸菌菌株
目測平板上菌落周圍透明圈的直徑，挑選出其中透明圈較大的10個獨立的菌落。將這10株菌株用接種環接種到斜面試管中，30°C下培養64 h后，將這10個試管保存到4°C冰箱中，作為菌種備用。將處理后的菌株接入液體培養基，30°C下180 r/min搖床培養64 h后，醋酸菌的產酸量達到55、55、56、57、58、59、59、59、60、60 g/L，而出發菌株的產酸量為44 g/L，其產酸量最低提高了 25%，最高提高了 36.4%。
[0016]4.遺傳穩定性測試
對其中3株產酸量最高的菌株，進行菌株傳代培養，傳代培養條件為溫度30°C，培養時間64 h，傳代10次，產酸量分別為49、51、52 g/L。
[0017]
實施例2
1.培養基的制備菌株培養液態培養基(搖瓶培養的培養基):葡萄糖10 g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，加入1000 mL蒸饋水，121°C高壓條件下滅菌20 min，加入30 mL無水乙醇。
[0018]菌株固態培養基(平板培養培養基):葡萄糖10g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉18 g，加1000 mL蒸餾水溶解，完全混勻后加入0.03%溴甲酚紫30 mL，121°C高壓條件下滅菌20 min，冷卻后加入30 mL無水乙醇。
[0019]2.磁場脈沖處理
將菌株(Acetobacter pasteurianus，中國工業微生物保藏中心，保藏編號:CICC22519)培養至對數生長期，取5 mL菌液于離心管中進行脈沖磁場處理，磁場強度選用8T，脈沖數10個。將處理完的菌液作梯度稀釋，稀釋到合適的梯度后取100 yL涂布于平板上，30 °C培養96 h，致死率達到80%。
[0020]3.高產醋酸菌菌株
目測平板上菌落周圍透明圈的直徑，挑選出其中透明圈較大的10個獨立的菌落。將這10株菌株用接種環接種到斜面試管中，30°C下培養96 h后，將這10個試管保存到4°C冰箱中，作為菌種備用。將處理后的菌株接入液體培養基，30°C下160 r/min搖床培養96 h后，醋酸菌的產酸量達到60、61、63、66、67、68、68、69、70、70g/L，而出發菌株的產酸量為50 g/L,其廣酸量最低提尚了 20%，最尚提尚了 40%。
[0021]4.遺傳穩定性測試
對其中3株產酸量最高的菌株，進行菌株傳代培養，傳代培養條件為溫度30°C，培養時間96 h，傳代10次，產酸量分別為60、62、63 g/L。
[0022]
實施例3
1.培養基的制備
菌株培養液態培養基(搖瓶培養的培養基):葡萄糖10 g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，加入1000 mL蒸饋水，121°C高壓條件下滅菌20 min，加入30 mL無水乙醇。
[0023]菌株固態培養基(平板培養培養基):葡萄糖10g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉18 g，加1000 mL蒸餾水溶解，完全混勻后加入0.03%溴甲酚紫30 mL，121°C高壓條件下滅菌20 min，冷卻后加入30 mL無水乙醇。
[0024]2.磁場脈沖處理
將菌株(從醋醅中分離得到并鑒定為醋酸菌)培養至對數生長期，取5 mL菌液于離心管中進行脈沖磁場處理，磁場強度選用5 T，脈沖數20個。將處理完的菌液作梯度稀釋，稀釋到合適的梯度后取100 yL涂布于平板上，35°C培養72 h，致死率達到88%。
[0025]3.高產醋酸菌菌株
目測平板上菌落周圍透明圈的直徑，挑選出其中透明圈較大的10個獨立的菌落。將這10株菌株用接種環接種到斜面試管中，35°C下培養72 h后，將這10個試管保存到4°C冰箱中，作為菌種備用。將處理后的菌株接入液體培養基，35°C下150 r/min搖床培養72 h后，醋酸菌的產酸量達到53、53、54、56、57、58、58、60、62、64g/L，而出發菌株的產酸量為40 g/L，其產酸量最低提高了 32.5%，最高提高了 60%。
[0026]4.遺傳穩定性測試
對其中3株產酸量最高的菌株，進行菌株傳代培養，傳代培養條件為溫度35°C，培養時間72 h，傳代10次，產酸量分別為53、55、56 g/L。
【主權項】
1.一種脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法，其特征在于按照下述步驟進行:將菌株培養至對數生長期，進行脈沖磁場處理，脈沖磁場的磁場強度范圍為4?8 T，脈沖數范圍為10?40個;將處理完的菌液作梯度稀釋，稀釋到合適的梯度后進行平板培養，28?35°C培養64?96h，將培養好的平板取出并進行菌落計數，以出發菌株為對照，計算致死率，選擇致死率為80%以上的平板進行培養;然后在30~35°C，150?180 r/min進行搖瓶培養，培養64?96 h后，即可提高醋酸菌產酸量。2.根據權利要求1所述的一種脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法，其特征在于菌株搖瓶培養培養基為:葡萄糖10 g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g, 1000 mL蒸饋水，30 mL無水乙醇，菌株平板培養培養基是在上述液態培養基的基礎上，加入18 g瓊脂粉和30 mL0.03%溴甲酚紫。3.根據權利要求1所述的一種脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法，其特征在于所用的出發菌株是任何一種醋酸菌，如中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)、中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)、中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)等保藏的菌種、以及從環境中分離得到的菌種;優選從醋醅中分離得到的任何一種醋酸菌。4.根據權利要求1所述的一種脈沖磁場提高醋酸菌產酸量的方法，其特征在于其中脈沖磁場的磁場強度為4?8 T，，脈沖磁場的脈沖數為10?40個。
【文檔編號】C12J1/00GK105820977SQ201610209114
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月6日
【發明人】錢靜亞, 尚磊, 沈凱譽, 高怡慧, 馬海樂
【申請人】江蘇大學