用于治療疾病和病癥的降鈣素模擬物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及降巧素的模擬物，并且延伸至其作為藥物在治療多種疾病和病癥(包 括但不限于糖尿病（I型和II型）、體重過重、過度食物攝入和代謝綜合征）、調節血糖水平、 調節針對葡萄糖耐量測試之響應、調節攝食、治療骨質疏松癥和治療骨關節炎中的用途。
[0002] 全世界約有2.5億糖尿病患者，并且預計在接下來的二十年內該數據將加倍。該群 體中有超過90%患有2型糖尿病(1796 2(11日6616 8 1]1611;[化3，1201)。據估計，患有1201或處 于明顯T2DM之前階段的人中只有50%至60%目前得到診斷。
[0003] T2DM是W碳水化合物和脂肪代謝異常為特征的異質性疾病。T2DM的原因是多因素 的并且包括影響組織(例如肌肉、肝、膜和脂肪組織）中的齡田胞功能和膜島素敏感性的遺傳 和環境要素二者。結果是，觀察到膜島素分泌受損并且伴隨著進行性的e細胞功能降低和慢 性膜島素抵抗。內分泌膜腺不能夠補償外周膜島素抵抗導致高血糖和臨床糖尿病的發生。 目前，認為針對膜島素介導的葡萄糖攝取的組織抗性是T2DM的主要病理生理學決定因素。
[0004] 最佳T2DM介入的成功標準是血糖水平降低，其可W是血糖水平長期降低和在食物 攝入后耐受高血糖水平的能力提高二者，它們由較低的峰值葡萄糖水平和較快的清除來描 述。運兩種情形對e-細胞膜島素輸出和功能的壓力都較小。
[0005] I型葡萄糖的特征在于：其喪失響應于攝食而產生膜島素的能力并且因此不能將 血糖調節至正常生理學水平。
[0006] 骨的物理結構可因為多種因素(包括疾病和損傷)而受到損害。最常見的骨疾病之 一是骨質疏松癥，其W骨組織的低骨量和結構退化（S化UCtural deterioration)為特征， 從而導致特別是髓部、脊柱和腕的骨脆性和骨折易感性提高。骨質疏松癥發生于存在運樣 的不平衡時:骨吸收速率超過骨形成速率。已表明，施用有效量的抗吸收劑(例如降巧素)防 止骨吸收。
[0007] 炎性或退行性疾病可由于疼痛和關節破壞而導致移動性顯著喪失，所述炎性或退 行性疾病包括關節疾病，例如骨關節炎（osteoarthritis, OA)、類風濕性關節炎 (rheumatoid a;rth;ritis，RA)或幼年型類風濕性關節炎（juvenile rheumatoid adhritis，JRA)，并且包括由自身免疫應答引起的炎癥，例如狼瘡、強直性脊柱炎 (ankylosing spond}ditis，AS)或多發性硬化(multiple sclerosis，MS)。關節內覆蓋并緩 沖山113111〇11)骨的軟骨可隨時間變得退化，因此不期望地允許兩塊骨直接接觸，從而可在關 節運動期間限制一塊骨相對于另一塊的運動和/或通過另一塊骨對一塊骨造成損傷。恰好 位于軟骨之下的軟骨下骨也可退化。施用有效量的抗吸收劑(例如降巧素)可防止骨吸收。 [000引 W02013/067357公開了天然降巧素的合成變體，其具有旨在提供經改善特性的經 修飾氨基酸序列。
[0009]降巧素在很多種物種間高度保守。全長天然降巧素的長度為32個氨基酸。下面示 出了天然降巧素實例的序列(在每種情況下，所述序列均具有C-末端酷胺化-未示出）：
[0010]
[0011] 多種天然降巧素與來自W02013/067357的UGP302的氨基酸序列比較如下：
[0012] 表1
[。01Tl
[(
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[0018] 本文中還W名稱邸P-042提及W02013/067357的膚UGP302。
[0019] 仍然需要開發運樣的降巧素類似物，其特別是在膜淀素(amylin)和降巧素受體激 動作用方面具有更進一步改善的特性，或者至少提供改善天然存在降巧素之特性的作為替 代的人工序列，同時消除CGRP-受體激動作用，并因此確保最佳的體內效力與安全性比例。
[0020] 相關的膚序列包括：
[0021] 表2 r00991
[0023] 其中，獨立地，X。是V或M;xb是K或R;X。是D或E;xd是K或R;xe是T或S;xf是F或Y;Xg是K 或R;并且Xh是P或Y，優選P。
[0024] 其他的目標膚序列示于下表中：
[0025]表2a [00261
[0027]其中X。是D或E，并且Xe獨立地是F或Y，并且所述序列各自可在其N-末端簇基化，或 者W其他方式修飾W降低第一個氨基酸的正電荷，并且獨立于此可在其C-末端酷胺化，并 且在所述序列中，其各自1位和7位的半脫氨酸殘基可一起被a-氨基辛二酸(Asu)替換。
[002引 表2b
[0029]
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[0030] 表 3[0031]
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[0038] 因此，本發明目前提供了具有表2a或表4a中的任一氨基酸序列的膚，所述氨基酸 序列各自可在其N-末端簇基化，或者W其他方式修飾W降低第一個氨基酸的正電荷，并且 獨立于此可在其C-末端酷胺化，在每個所述氨基酸序列中，1位和7位的半脫氨酸殘基可一 起被Q-氨基辛二酸(Asu)替換。
[0039] 本發明包括具有表3中的任一氨基酸序列的膚。
[0040] 本發明還包括具有表化或表4b中的任一氨基酸序列的膚，所述氨基酸序列各自可 在其N-末端簇基化，或者W其他方式修飾W降低第一個氨基酸的正電荷，并且獨立于此可 在其C-末端酷胺化，在每個所述氨基酸序列中，1位和7位的半脫氨酸殘基可一起被a-氨基 辛二酸(Asu)替換。
[0041] 在對天然降巧素之眾多32-氨基酸類似物的活性進行研究，特別是研究高效激活 受體介導的響應需要哪些氨基酸之后，我們已發現編號為11、15、18、22、24、30和31的氨基 酸在氨基酸類型方面更為嚴格，其中優選的值為：11位是K或R，15位是D或E，18位是K或R，22 位是Y或F，24位優選是K但是R也有效，30位是N，并且31位是A。
[0042] 所述膚可配制成作為藥物施用，并且可配制成用于經腸（enteral)或腸胃外 (parenteral)施用。優選的制劑是可注射的，優選用于皮下注射，然而所述膚可與載體一起 配制成用于經口施用，并且任選地其中所述載體提高該膚的經口生物利用度。合適的載體 包括含有5-CNAC、SNAD或SNAC的那些。
[0043] 任選地，所述膚配制成含有經包衣巧樣酸顆粒的用于經口施用的藥物組合物，并 且其中所述經包衣巧樣酸顆粒提高該膚的經口生物利用度。
[0044] 本發明包括本發明的膚，其用作藥物。所述膚可用于治療糖尿病（I型和/或II型）、 體重過重（excess bodyweight)、過度食物攝入（excessive food consumption)、代謝綜合 征、類風濕性關節炎、非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease)、骨質疏 松癥或骨關節炎、血糖水平調節不良（poorly regulated blood glucose level)、針對葡 萄糖耐量測試之響應調節不良（poorly regulated blood glucose level)或食物攝入調 節不良（poorly regulated of food in化ke)。特別地，所述膚可用于降低不期望高的空腹 血糖水平或者降低不期望高的HbAlc或者降低不期望高的針對葡萄糖耐量測試的響應。
[0045] 在一些實施方案中，上文中討論的降巧素模擬物的N-末端側經修飾W降低第一個 氨基酸的正電荷。例如，可在半脫氨酸-1上進行乙酷基、丙酷基或班巧酷基取代。在表3中， "Ac"指乙酷基修飾。表3中的每個'Ac'可替換成"Pr",運稱為丙酷基修飾；或者替換成 "Succ"，運成為班巧酷基修飾。"N此"指酷胺化的C-末端簇酸基團。降低正電荷的作為替代 的方式包括但不限于基于聚乙二醇的PEG化(PEGylation)或在N-末端添加其他氨基酸，例 如谷氨酸或天冬氨酸。或者，可向上文中討論的膚的N-末端添加其他氨基酸，包括但不限于 賴氨酸、甘氨酸、甲酯基甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乙酷基丙氨酸和二丙氨酷。本領域技術人 員將認識到，具有多個半脫氨酸殘基的膚常常在兩個運樣的半脫氨基酸殘基之間形成二硫 鍵。本文中所示的所有此類膚限定為任選地特別是在切Sl至切s7的位置包含一個或更多個 運樣的二硫鍵。模擬運一情況，1位和7位的半脫氨酸殘基可共同被a-氨基辛二酸連接替換。 本文中公開的具有KBP-0##編號的所有膚均具有運樣的二硫鍵。
[0046] 盡管本公開內容的降巧素模擬物可W W游離酸形式存在，但是優選地C-末端氨基 酸被酷胺化。申請人預期，運樣的酷胺化可有助于膚的有效性和/或生物利用度。用于制備 本公開內容的降巧素模擬物的酷胺化形式的優選技術是:根據已知的技術在膚基甘氨酸O-酷胺化單加氧酶存在下使前體反應(用甘氨酸替代所期望酷胺化產物的C-末端氨基），其中 所述前體在反應中被轉化為酷胺化產物，運描述于例如US4708934W及EP0308067和 EP0382403 中。
[0047] 重組產生對于前體和催化前體轉化為娃魚降巧素的酶二者而言都是優選的。運樣 的重組產生由Ray MV、Van Duyne P、Be;rtelsen AHJackson-Matthews DE、Stu;rmer AM、 Merkler DJ、Consalvo AP、Young SD、Gilligan JP、Shields PP.在Biotechnology，Vol.11 (1993)第64-70頁中進行