檢測小麥是否含有簇毛麥6v#4s染色體臂的成套試劑與分子標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域中檢測小麥遺傳背景中是否含有簇毛麥6V#4S染色體臂 的成套試劑與分子標記。
【背景技術】
[0002] 簇毛麥D曰sypyrum villosum(L. )P.C曰nd曰rgy(syn.H曰yn曰Idi曰 villos曰 Schur)是 小麥族簇毛麥屬的一個二倍體種，化=2x= 14。它起源于地中海的東北部，從南歐的法國南 部到里海，西南亞，俄羅斯和高加索地區（De化Ce等1995;Frederiksenl991)，是一種雜草 類植物，生長在惡劣、干旱的環境中（Agnieszka Gradzielewska,2006)。由于其穎殼脊上和 外釋頂端有叢生的毛狀物，故名之。
[0003] 簇毛麥含有許多生物脅迫和非生物脅迫抗性基因及優質基因，是改良小麥的優良 基因源。Sears、Lukaszewski和劉大均等先后將簇毛麥基因組轉移到小麥的遺傳背景，育成 3套染色體附加系。根據簇毛麥來源的不同，Qi等（1998)首先將Sears培育的小麥-簇毛麥附 加系用DA1V#1-DA7V#1表示，將南京農業大學培育的小麥-簇毛麥附加用DA1V#2-DA7V#2表 示，Liu等(2011)隨后將A.J丄Ukaszewski培育的附加系用DA1V#3-DA7V#3表示，申請人將前 蘇聯簇毛麥No. 1026衍生的6VS染色體命名為6V#4S(Lin等，2013)。
[0004] 6V#1 S，6V#2S，6V#3S和6V#4S染色體臂的區別僅在于來源地不同。6V#1 S，6V#2S， 6V#3S和6V#4S染色體短臂來源不同對小麥白粉病抗性也表現不同。攜帶6V#1S和6V#3S染色 體的小麥不抗白粉病，而具有6V#2S和6V#4S染色體的小麥對白粉病均表現免疫化iu等， 2011)。
[0005] 陳佩度等（1995)利用6V#2(6A)異代換系與揚麥5號雜交，結合雜種后代的丫-射線 處理，成功選育出抗白粉病T6V#2S ? 6AL易位系，其抗病基因命名為化21(Qi等，1996)。陳孝 等（1996)利用來自前蘇聯的簇毛麥No. 1026培育了硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體THl，TH2和 TH3,及抗白粉病的6V#4(6D)代換系94622-1、94625-1、94632-1和94633-1，利用1'冊與小麥 品種宛7107雜交、回交，未成熟胚培養及/花藥培養等方法，培育出6V#4S ? 6化染色體易位 系化97033、化97034和 Rii97035(Li 等，2005)。
[0006] 雖然6V#2S ? 6AL易位系和6V#4S ? 6化易位系對小麥條紋花葉病毒及其傳媒載體-小麥卷曲蛾的敏感性不同；在染色體水平上，2條外源染色體臂也與不同的小麥染色體建立 了連鎖關系，但二者對白粉病菌所有小種表現免疫，故在白粉病抗性表型上難于相互區分。
[0007] 基于PCR擴增的分子標記是一種鑒定外源染色體的簡便手段。目前為止，針對6V# 2S ? 6AL易位系開發的特異PCR標記有如下7個。Qi等通過隨機引物擴增法篩選的RAPD標記 0PH17;Liu等將該標記的擴增片段回收測序后轉化為穩定的SCAR標記SCARi7〇o;Cao等 (2006)基于一個受白粉菌誘導表達的絲/蘇氨酸蛋白激酶基因（Contigl7515)序列開發了 一個可同時擴增6VS/6AS/6BS/6DS的共顯性標記NAU/xibaol5F和NAU/xibaol5R;畑en (2006)等利用抑制差減雜交獲得一個在攜帶Pm21的抗病系中特異表達的富亮氨酸結構域 基因化-LRR2，將其轉化為PCR標記，可特異擴增6VS和6AS;王春梅等(2006)對11個抗病基因 同源序列（RGA)和17對STS引物進行多態性分析，獲得2個穩定的特異性分子標記 CINAU17-1086和CINAU18-723 ,可特異擴增6VS染色體臂。上述化0、化en和王春梅等開發的標 記均在聚丙締酷胺凝膠中分離。
[000引對6VMS ?抓L易位系，李輝等（2005)篩選了5個6VS染色體特異的RAPD分子標記， 其中OPAL03750僅能從攜帶6V#4S染色體臂的簇毛麥和小麥中擴增，成為區別于6V#2S ? 6AL 的分子標記。申請人也開發了 1個可特異區別6V#2S ? 6AL和6V#4S ?抓L的分子標記(張云龍 等，2012)。
[0009] 最近，Bie等（2015)篩選出一個可同時鑒定6V#2S/6V#4S/6AS/6DS的分子標記 MBHl。
[0010] 小麥白粉病是由活體營養白粉菌小麥專化型（Blumeria graminis forma specialis化itici)引起的一種世界性真菌病害，常造成小麥產量的嚴重損失。目前中國 多數大面積推廣的小麥品種對白粉病的抗性較差，限制了其推廣應用的范圍和年限。因此， 選育高抗白粉病的小麥品種和改良目前推廣優良小麥品種的白粉病抗性，是防治小麥白粉 病，實現小麥安全生產最安全、有效的措施。迄今為止，在小麥農家品種和野生近緣種中已 經發掘了多個白粉病抗性基因，并開發了一些抗病基因的分子標記。但白粉菌的生理小種 變異快，很多抗病基因在生產上使用不久就被新的小種所克服。抗白粉病是小麥育種的一 個長期而重要的內容。來自簇毛麥化aynaldia villosa)的6V#2S ? 6AL和6V#4S ? 6化易位 系因對小麥白粉病菌所有生理小種免疫，表現出一種廣譜的抗性，目前已被廣泛用于育種 計劃。一些品種或品系的系譜中包含了 2個易位系，后代抗源的歸屬有待鑒定。另方面，由于 6V#2S和6V#4S染色體屬于相同同源群，其抗性是否相同一直是個懸而未解的問題，獲得特 異染色體臂上不同位點的遺傳標記有助于對此開展深入的研究。因此，無論對于抗病育種 的輔助選擇，還是對于理論研究，都迫切需要開發大量特異于目標染色體的分子標記。

【發明內容】

[0011] 本發明所要解決的技術問題是如何檢測小麥遺傳背景中是否含有簇毛麥6V#4S染 色體臂。
[0012] 為解決上述技術問題，本發明首先提供了檢測或輔助檢測小麥是否含有簇毛麥 6VMS染色體臂的成套試劑，其名稱為成套試劑2。所述成套試劑2由F-P與試劑a組成，所述 試劑a為G-P和/或H-P;
[0013] 所述F-P由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成；
[0014] 所述G-P由序列表中序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA組成；
[0015] 所述H-P由序列表中序列15和序列16所示的兩條單鏈DNA組成。
[0016] 所述成套試劑2中的各單鏈DNA均可獨立包裝，也可包裝在一起;也可將其中的各 引物對單獨包裝。所述成套試劑2中各單鏈DNA的摩爾數比例可W根據實際檢測的樣品進行 調整，所述成套試劑2中各單鏈DNA的摩爾數也均可相同，所述成套試劑2中各引物對的摩爾 數也均可相同。
[0017] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測小麥是否含有簇毛麥6V# 4S染色體臂的引物對，該引物對為所述F-P。
[0018] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測小麥是否含有簇毛麥6V# 4S染色體臂的成套試劑，其名稱為成套試劑2-1。所述成套試劑2-1由所述成套試劑2或所述 F-P與Yl組成;所述Yl為B-P、C-P、D-P和E-P中的至少一種；
[0019] 所述B-P由序列表中序列巧日序列4所示的兩條單鏈DNA組成；
[0020] 所述C-P由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成；
[0021] 所述D-P由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成；
[0022] 所述E-P由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成。
[0023] 所述成套試劑2-1中的各單鏈DNA均可獨立包裝，也可包裝在一起;也可將其中的 各引物對單獨包裝。所述成套試劑2-1中各單鏈DNA的摩爾數比例可W根據實際檢測的樣品 進行調整，所述成套試劑2-1中各單鏈DNA的摩爾數也均可相同，所述成套試劑2-1中各引物 對的摩爾數也均可相同。
[0024] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測小麥是否含有簇毛麥6V# 4S染色體臂的系統。所述系統為系統Bl、系統B2或系統B3;
[0025] 所述系統Bl由所述成套試劑2與進行PCR擴增所需的試劑和/或儀器組成；
[0026] 所述系統B2由所述F-P與進行PCR擴增所需的試劑和/或儀器組成；
[0027] 所述系統B3由所述成套試劑2-1與進行PCR擴增所需的試劑和/或儀器組成。
[0028] 上述系統中，所述系統B1、所述系統B2和所述系統B3中的進行PCR擴增所需的試劑 均可為DNA聚合酶或含有DNA聚合酶的試劑（如2x Taq MasterMix)。社hq MasterMix可為 北京康為世紀生物科技有限公司產品，貨號為CW0682A。所述系統B1、所述系統B2和所述系 統B3中的進行PCR擴增所需的儀器可為PCR儀。所述PCR儀可為Bio-RAD T100? Iliermal Cyclero
[0029] 為解決上述技術問題，本發明還提供了簇毛麥分子標記。所述簇毛麥分子標記為 為分子標記bl、分子標記b2或分子標記b3;
[0030] 所述分子標記bl由F與b組成，所述b為G和H組成；
[0031] 所述F為序列22所示的DNA分子，該DNA分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述F-P進行PCR擴增得到的DNA分子；
[0032] 所述G為序列23所示的DNA分子，該DNA分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述G-P進行PCR擴增得到的DNA分子；
[0033] 所述H為序列24所示的DNA分子，該DNA分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述H-P進行PCR擴增得到的DNA分子；
[0034] 所述分子標記b2為所述F;
[0035] 所述分子標記b3由所述分子標記bl或所述分子標記b2與Vl組成;所述Vl為B、C、D 和E中的至少一種；
[0036] 所述B為序列18所示的DNA分子，該DNA分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述B-P進行PCR擴增得到的DNA分子；
[0037] 所述C為序列19所示的DNA分子，該DNA分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述C-P進行PCR擴增得到的DNA分子；
[003引所述D為序列20所示的DNA分子，該DNA分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述D-P進行PCR擴增得到的DNA分子；
[0039] 所述E為序列21所示的DNA分子，該DM分子為W簇毛麥基因組DNA為模板用所述E-P進行PCR擴增得到的DNA分子。
[0040] 為解決上述技術問題，本發明還提供了檢測或輔助檢測小麥是否含有簇毛麥6V# 4S染色體臂的方法。所述方法為下述Tl)或T2):
[0041 ] Tl)包括下述 T11)和 T12):
[0042] T11)分別W待測小麥、參比小麥和簇毛麥的基因組DNA為模板，用巧巾引物對分別 進行PCR擴增，得到所述巧中引物對的待測小麥PCR產物、所述巧中引物對的參比小麥PCR產物 和所述巧巾引物對的簇毛麥PCR