微生物的檢查方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種微生物的檢查方法，特別涉及用于同時迅速地檢測多種微生物的 檢查方法。
【背景技術】
[0002] 以往，在食品制造現場或臨床現場、以及文物等的保護環境等中，檢查是否存在有 霉菌等微生物、確認安全性、并且防止其繁殖十分重要。
[0003] 作為此種以微生物、特別是霉菌作為對象的檢查方法，可以舉出以下所示的3種方 法。
[0004] 首先，作為第一方法，可以舉出如下的方法，即，從環境中采集試樣而進行前培養 (所采集的菌的同時培養），然后，在對每個菌種最佳的培養基中進行20天左右的培養后，觀 察形態的特征，由此來鑒定微生物，進行其存在與否的確認(參照專利文獻1)。
[0005] 另外，作為第二方法，可以舉出如下的方法，即，從環境中采集試樣而進行前培養 后，對各菌進行單獨培養，從培養細胞中提取DNA，利用PCR(聚合酶鏈式反應)法擴增靶區 域，分析該區域的堿基序列，由此進行微生物的鑒定及存在確認。
[0006] 此外，作為第三方法，可以舉出如下的方法，即，制成包含與靶區域互補地結合的 堿基序列的探針并固定化在DNA芯片的基板上，將借助PCR法的擴增產物滴加至DNA芯片，使 靶區域與探針雜交，進行試樣中所含的微生物的鑒定及存在確認(參照專利文獻2)。
[0007] 基于形態進行微生物的鑒定的第一方法需要在進行前培養而生長后單獨地進行 培養。此時為了表達微生物的形態的特征，需要對每個菌種準備最佳的培養基并進行長時 間的培養，因此根據微生物種類會需要長達50天左右的檢查期間。另外，在微生物的鑒定時 需要熟練，因此不適于迅速的檢查或簡易的檢查。
[0008] 在借助序列分析的第二方法中，也需要在前培養后對每個菌種單獨進行培養。因 此，作為檢查期間需要14天左右。另外，由于是對每個菌種單獨進行分析的方法，因此不適 于需要同時檢查多個樣品的情況。
[0009] 另一方面，在使用DNA芯片的第三方法中，可以不用對每個菌種單獨進行培養地檢 測微生物，能夠將檢查期間縮短到9天左右。
[0010] 然而，迫切期望使檢查進一步加速，也就是在檢查現場，在從環境中采集試樣的當 天之中即想要知道其結果。
[0011]但是，在使用DNA芯片的第三方法中也需要前培養，該前培養需要7天左右，因此第 三方法無法響應該要求。
[0012] 此處，提出過能夠不進行前培養地實施使用了 DNA芯片的微生物的檢查的、用于微 小有機體的迅速的檢測的方法(參照專利文獻3)。
[0013] 專利文獻1:日本特開號公報 [0014] 專利文獻2:日本特開2008-35773號公報 [0015] 專利文獻3:日本特開號公報

【發明內容】

[0016] 發明所要解決的問題
[0017] 然而，該用于微小有機體的迅速檢測的方法是從微生物中提取RNA的方法，在微生 物為孢子形態的情況下，無法獲得RNA。另一方面，無法選擇性地捕集非孢子形態的微生物， 因此存在有需要用于使孢子發芽的恢復工序的問題。
[0018] 另外，為了能夠不進行RNA或與之互補的DNA的擴增地檢測微生物，需要捕集數量 非常多的微生物的細胞（實施例中使用百萬個細胞。在比較骯臟的環境下，取樣需要數 天。），存在有難以縮短包括取樣在內的整個檢查的期間的問題。
[0019] 本發明是鑒于上述情況而完成的，其目的在于，提供一種能夠進一步縮短包括取 樣在內的整個檢查的期間的微生物的檢查方法。
[0020] 用于解決問題的方法
[0021] 為了達成上述目的，本發明的微生物的檢查方法是同時判定環境中是否存在多種 微生物的微生物的檢查方法，具有:采集工序，將飄浮于空氣中的微生物回收到液體中；核 酸提取工序，從液體中的微生物中提取核酸；核酸擴增工序，將所提取的核酸的一部分擴 增;和檢測工序，將含有經過擴增的核酸的溶液滴加到預先固定化有多種微生物的核酸的 載體中，在與經過擴增的核酸互補地結合的核酸被固定化在載體上的情況下，鑒定微生物 的種類，在采集工序之后、且核酸提取工序之前，不進行微生物的培養。
[0022]發明效果
[0023]根據本發明，可以提供能夠進一步縮短包括取樣在內的整個檢查的期間的微生物 的檢查方法。
【附圖說明】
[0024]圖1是表示實施例的空氣采樣器所回收的空氣量與霉菌數的關系的圖表。
[0025]圖2是表不實施例中使用的引物的喊基序列的圖表。
[0026 ]圖3是表不實施例中使用的探針的喊基序列的圖表。
[0027] 圖4是表示實施例的借助DNA芯片的檢測結果(S/N比）的圖表。
【具體實施方式】
[0028] 以下，對本發明的優選的實施方式進行詳細說明。
[0029] 本發明的實施方式的微生物的檢查方法是同時判定環境中是否存在多種微生物 的微生物的檢查方法，其特征在于，具有:采集工序，將飄浮于空氣中的微生物回收到液體 中；核酸提取工序，從液體中的微生物中提取核酸;核酸擴增工序，將所提取的核酸的一部 分擴增;和檢測工序，將含有經過擴增的核酸的溶液滴加到預先固定化有多種微生物的核 酸的載體中，在與經過擴增的核酸互補地結合的核酸被固定化在載體上的情況下，鑒定微 生物的種類，在采集工序之后、且核酸提取工序之前，不進行微生物的培養。
[0030] 本實施方式的微生物的檢查方法可以包括以下的工序。
[0031] (!)采集工序
[0032] 采集工序中，將飄浮于空氣中的微生物回收到液體中。此時，作為用于回收微生物 的取樣裝置，優選使用氣旋式的空氣采樣器。另外，作為液體，為了提高微生物的回收效率， 優選使用含有表面活性劑的液體。
[0033]通過使用氣旋式的空氣采樣器，空氣被高速地以螺旋狀取入取樣容器的液體中后 排出，在該過程中空氣中的微粒因離心力而附著于取樣容器的內壁。由此，就可以將空氣中 的微生物回收到取樣容器的液體中。
[0034]作為氣旋式的空氣米樣器，例如可以合適地使用Coriolis μ(液相離心分離法式： 液體氣旋，Bertin公司制）。
[0035]在使用氣旋式的空氣采樣器的情況下，優選以300L/分鐘的流速進行1~10分鐘空 氣的抽吸。
[0036]通過像這樣在采集工序中使用氣旋式的空氣采樣器，就可以在短時間內從大量的 空氣中將比較多的微生物回收到液體中。因此，即使在核酸提取工序之前不進行微生物的 培養(前培養），也可以在核酸擴增工序中充分地擴增微生物的核酸，可以在檢測工序中檢 測該微生物。
[0037] 另外，由于不需要進行微生物的前培養，因此也可以降低由于培養基的條件的原 因而無法恰當地生長微生物、從而無法檢測該微生物的風險。
[0038] 在本實施方式的微生物的檢查方法中，"微生物"中包括霉菌或酵母等真菌、食物 中毒菌等細菌、以及其他的不使用顯微鏡就無法看到的微小的生物。
[0039] 特別是，根據本實施方式的微生物的檢查方法，可以恰當地檢測在食品檢查、流行 病學的環境檢查、環境檢查、臨床試驗、及家畜衛生等中重要的飄浮于空氣中的胞子或菌絲 形態的霉菌。
[0040] 另外，由于不需要進行微生物的培養，因此不僅可以從活的微生物，而且還可以從 死菌等微生物的殘骸，來鑒定該微生物的種類。
[0041 ] (2)核酸提取工序
[0042]核酸提取工序中，從采集工序中得到的液體中的微生物中提取核酸。由此，就可以 從微生物中獲得基因組DNA。核酸的提取可以利