新型抗-Fc-γ受體IIB抗體及其用圖
【專利說明】新型抗-Fc- γ受體I IB抗體及其用途
【背景技術】
[0001]作為蛋白質的免疫球蛋白基因超級家族的成員，Fey RII受體是由兩個細胞外免 疫球蛋白結構域、一個單跨膜結構域和一個長度變化的胞漿結構域組成的單一多肽鏈 40kDa完整膜結合的糖蛋白。Fc γ RII受體在多種造血細胞上表達，是人血小板和巨核細胞 上的唯一Fc-受體（Cassel，McKenzie, 1993)。已知人的三種Fc γ RII受體，Fc γ RIIA、Fc γ RIIB和FcyRIIC，它們均結合IgG(例如以1-2X106M4的親和性結合IgG〇或免疫復合物（IC， 例如IgG調理的病原體）dFc γ RIIA和Fc γ RIIB主要由于胞質結構域中的差異而互不相同， 所述差異最終導致受體連接后的功能性異質反應。Fc γ RIIA觸發導致細胞的活化(例如吞 噬作用和呼吸爆發），而Fc γ RIIB起始抑制性信號，從而導致例如Β細胞活化的抑制。Fc γ RIIC與Fc γ RIIB共享胞外結構域，與Fc γ RIIA共享胞質結構域，從而在結合IgG或1C后傳遞 活化信號。Fc γ RIIB在除T細胞和NK細胞以外的所有白細胞上表達，是在人B細胞上表達的 唯一的抑制性Fc受體。單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞共表達 活化的Fc γ RIIA，而抑制性Fc γ RIIB受體和Fc γ RIIC在自然殺傷細胞(NK細胞)上表達并構 成該類細胞上的唯一 Fey R。已知Fey RIIB的兩種在生物學功能不同的同種型。Fey RIIB-1 唯一地在B細胞上表達，而發現在1C結合后引起內吞-/吞噬作用誘導的Fc γ RIIB-2在所有 其他？。丫1?1113表達細胞上表達(附11111161'」&1111，1^￥61:。11，2008)。
[0002] ?〇丫1?118在胞外區中與？〇丫1?114享有93%的同源性。如上所述^〇丫1?118與卩〇丫 RIIA之間的主要差異存在于胞質結構域。Fc γ RIIB包含ΙΤΙΜ(基于免疫受體酪氨酸的抑制 基序），而Fc γ RIIA包含ΙΤΑΜ(基于免疫受體酪氨酸的活化基序）。
[0003] 通過1C結合的FcyRIIA簇集引起ΙΤΑΜ基序與引發ΙΤΑΜ基序(共有序列:￥12-171-X 8-Y-X2-L/I，Isakov，1997)中酪氨酸殘基磷酸化的受體相關激酶的共定位以及隨后與激酶 Syk相互作用，所述激酶Syk通過大量下游信號傳導和基因活化事件來引發細胞的活化 (Ghazizadeh等，1994)。結合活性Fc γ RIIA的免疫球蛋白引起促炎性反應，該促炎性反應隨 后導致病原體的去除，但在自身抗體的情況下，還可導致健康組織的破壞，從而達到病理性 自體免疫疾病峰。因此，需要對抗體特異性的嚴格控制和否定性反饋系統來避免免疫系統 對機體的異常破壞。所述抑制性Fc γ RIIB受體就是該否定性反饋系統的一部分。
[0004] Fc γ RIIB的特征在于在胞質結構域中存在Ι??Μ基序(共有序列:V/I-X-Y-X2-V/L， Isakov，1997)，其在Ig-聚集體或1C結合和與攜帶ΙΤΑΜ的活化Fc γ受體共連接后被激酶Lyn 磷酸化。經磷酸化的ITIM吸引多磷酸肌醇5'-磷酸酶的SH2-結構域(SHIP)，SHIP轉而水解磷 酸肌醇信使，所述磷酸肌醇信使由于含ITAM的FeyR-介導的酪氨酸激酶活化而釋放，因而 阻止細胞內Ca 2+的流入。Fc γ RIIB交聯抑制對Fc γ R連接的活化反應，其繼而抑制B細胞活 化、增殖和抗體分泌。
[0005] Fey RIIB具有兩種抑制活性。如上所述，其一依賴于ΙΤΙΜ基序并在Fey RIIB連接 到攜帶ΙΤΑΜ的受體(例如Fey RIIA)時發生，導致ΙΤΑΜ觸發的鈣動員和細胞增殖的抑制。這 就意味著諸如脫粒作用、吞噬作用、ADCC、細胞因子釋放和促炎活化的鈣依賴性過程以及Β 細胞增殖都被Fc γ RIIB阻斷。Fc γ RIIB的第二種抑制活性包括Β細胞上受體的同型聚集(Fc γ RIIB簇集）。同型聚集將促細胞凋亡信號遞送到細胞質中，這可被Fc γ RIIB與B細胞受體 (BCR)的連接所阻斷。多價-抗原結合后的BCR信號傳導的特征在于簇集的BCR通過Lyn(Src 家族的一種激酶)磷酸化。這種Lyn作用下的磷酸化與BCR和被稱作"脂筏"的富含鞘脂和膽 固醇的膜微結構域的聯合一起發生。這些不溶的"脂筏"在免疫突觸的形成中起著重要作 用。已觀察到，BCR與APC(抗原提呈細胞)上的抗原的相互作用致使在所接合的B細胞和APC 的界面處形成該免疫突觸。Fey RIIB與BCR的共連接使BCR與脂筏的聯合去穩定，隨后阻斷B 細胞的免疫突觸的形成。BCR信號傳導的Fc γ RIIB抑制包含受體的細胞質結構域的ITIM中 的酪氨酸殘基被激酶Lyn磷酸化以及隨后的肌醇磷酸酶SHIP的募集(Daeron等.，1995， Ravetch and Bolland,2001)。
[0006] 科學界接受這樣的觀點：Fey RIIB可被看作外周B細胞發育過程中較晚檢查點 (checkpoint)，并且其還直接調節漿細胞存活。因此Fey RIIB被認為是用于治療B細胞障 礙、特別是B細胞介導的免疫反應的重要靶標。
[0007] 在小鼠和人中的研究已經闡明Fc γ RIIB對B細胞活性和體液耐受的影響，其中Fc yRIIB表達的降低或缺少造成了明顯的自身免疫性疾病的發展或加劇。事實上，Fey RIIB 在諸如原發免疫性血小板減少癥、全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎(RA)、大皰性天皰瘡、 尋常型天皰瘡和其他天皰瘡形式、B細胞驅動的多發性硬化癥的自身免疫性疾病以及其他 以病原性免疫復合物發展為特征的自身免疫性疾病的發展和過程中起到關鍵作用。在健康 個體的免疫反應期間，已經進入血液循環的病原體受到針對病原體生物體的表位的抗體 (免疫球蛋白，Ig)的調理，并繼而導致所謂的免疫復合物的形成。這些免疫復合物隨后會被 免疫系統的特定細胞(如巨噬細胞、中性粒細胞、吞噬細胞)所吞噬，這導致病原體生物體從 血液循環中被清除。另外已經證明，Fc γ RIIB在外周耐受性方面也起著關鍵作用，因為Fc γ RIIB敲除小鼠發展自發的自身免疫性疾病。Fc γ RIIB不足導致對誘發的自身免疫性疾病的 易感性(Bolland和Ravetch，2000)。
[0008] 與健康人相比，在遭受自身免疫性疾病的患者中，Fc γ RIIB在B細胞上的表達通常 會減弱或降低。然而例如幼稚Β細胞顯示出正常的Fc γ RIIB表達，來自RA患者的記憶Β細胞 和衆母細胞則顯示出這一受體的表達降低(Catal;in，2010) Jiang及同事也能夠表明，在來 自健康捐贈者的漿母細胞上通過表面耦合的抗-Fc γ RIIB抗體2.4G2的Fc γ RIIB交聯導致 細胞凋亡(Xiang等，2007)
[0009] 基于上述的Fey RIIB在自身免疫性疾病中的顯著作用，已經開發了針對該受體的 抗體，以便治療或診斷患者。W0 2009/083009公開了針對Fc γ RIIB兩種同種型的抗體，而TO 2004/016750公開了與內源表達于人細胞上的Fey RIIB的細胞外結構域特異性結合的抗 體，其親和力是與表達于人細胞上的Fc γ RIIA結合的此類抗體的親和力的至少10倍(記住 FcyRIIA和Fey RIIB的細胞外結構域享有高度同一性hEP 1 709 073公開了對Fey RIIB 具有高度特異性的抗體及其用于診斷和治療自身免疫性疾病、感染病、腫瘤和其他異常病 癥的用途。
[0010] 為了這樣的目的，十分需要使用對該受體具有高特異性和親和性的抗體。特別是 高特異性降低所述抗體交叉反應的風險，由此降低不利副作用，而高親和性增強其應用的 效力和功效。同時也需要這樣的抗體是非阻斷性的，即它們通過其可變區與Fc受體的結合 不會干擾免疫復合物（1C)或聚集的IgG與細胞的結合。而且，針對Fey RIIB的抗體的一個非 常有利的優勢在于:其影響Fc γ RIIB抑制耦合機制以控制B細胞活化。也就是說，已知Fc γ RIIB的細胞內部分包含所謂的Ι??Μ，并且通過攜帶Ι??Μ的受體的信號傳導往往在免疫系統 的調節中是抑制性的。如上所述，已知Fc γ RIIB在被IgG分子的Fc部分結合時具有抑制性調 節功能。因此，需要利用Fey RIIB的抑制性調節功能，以期對包含在特別是自身免疫性疾病 中的B細胞進行控制。總而言之，盡管現有技術已經公開了若干具有不同特異性和親和性的 抗Fc γ RIIB抗體，但仍然需要改善的抗Fc γ RIIB抗體用于治療、預防和診斷受試者的自身 免疫性疾病。
[0011]通過提供本文下文描述的、在權利要求中進行表征且通過隨附的實施例和附圖進 行說明的抗體，本申請滿足了這一需求。
[0012] 使本發明的發明人十分驚訝的是，他們觀察到本發明所提供的抗體顯著地增強了 ΙΤΙΜ的磷酸化。與現有技術中公開的也與Fc γ RIIB特異性結合的抗體相比，根據本發明所 述的抗體驚人地表現出意料之外的更強的對ΙΤΙΜ磷酸化的作用。這樣更強的作用是有益 的。尤其是活化-抑制耦合，即陽性信號與抑制環的配對，控制許多生物過程的量級和持續 時間。在Β淋巴細胞中，克隆型Β細胞受體(BCR)對抗原的識別誘導能夠指導克隆擴增、分化、 細胞因子釋放并最終產生Ig的信號。活化刺激物的枯竭以及包含抑制性Fc γ受體(Fc γ R) 即Fey RIIb(CD32B)的負反饋環的觸發防止不受控制的活化。后一種機制在BCR識別免疫復 合抗原時觸發，從而導致通過復合結合的IgG的Fc結構域的CD32B共存接合，因而防止與被 可溶性IgG識別的那種享有相同特異性的B細胞克隆的擴增。因此，成功的負調節策略應形 成用于負信號傳導環的分子基礎。

【發明內容】

[0013] 本發明提供的抗體在CD32B的ΙΤΙΜ磷酸化方面表現出顯著更強的作用，因而預期 它們對由CD32B的ΙΤΙΜ磷酸化觸發的負信號傳導環具有更強的影響，這繼而控制特別是包 含在自身免疫性疾病中的Β細胞。
[00?4]特別地，與未經所述抗體處理的Daudi細胞相比，本發明的抗體優選地增強Daudi 細胞的？〇丫1?118的11']磷酸化。所述增強優選為1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。從與〇)328 結合的現有技術抗體，既無法預料也無法預見本發明所述的抗體的有利性質，更不必說成 功提供它們的合理預期，特別是本文所表征的CDR或可變重和/或輕鏈。除了本發明抗體這 一改善的性質，本文所述的抗體還對人Fc γ RIIB具有高特異性和/或是非阻斷性的，即它們 通過其可變區與Fc受體的結合不會干擾免疫復合物(1C)或聚集的IgG與細胞的結合。
[0015]因此，本發明提供一種抗-Fc γ RIIB抗體，優選為IgG型的抗-Fc γ RIIB抗體，所述 抗體在其重鏈可變區中包含SEQIDN0s.29、30和31中所示的H-CDRl、H-CDR2和H-CDR3，并 且在其輕鏈可變區中包含SEQ ID NOs. 32、33和34中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。相比 于未經所述抗體處理的Daudi細胞，所述抗體使Daudi細胞的Fc γ RIIB的ITIM磷酸化增強約 4至10倍。
[0016] 從圖7中明顯可見，現有技術抗體GB3(見W0 2005/051999)和2B6(見W0 2004/ 016750)不能如本發明的抗體(諸如8A6,或者作為嵌合的或作為人源化的8A6抗體)那樣增 強Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化。故而能否增強Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化似乎取決于CDR，特別是取 決于存在于8A6中而非GB3和/或2B6中的一些關鍵殘基。因此，僅存在于8A6的⑶Rs中的處于 對應于2B6或GB3的CDR內各自位置的位置處的氨基酸可以被看作"關鍵殘基"。
[0017] 對2B6、GB3和8A6中的CDR關鍵殘基的視覺比較表明，本發明的抗體在H-CDR1中包 含SEQIDN0.29中所示的氨基酸序列，在H-CDR2中包含SEQIDN0.30中所示的氨基酸序 列，在H-CDR3中包含SEQIDN0.31中所示的氨基酸序列，在L-CDR1中包含SEQIDN0.32中 所示的氨基酸序列，在L-⑶R2中包含SEQ ID NO.33中所示的氨基酸序列，在L-⑶R3中包含 SEQ ID NO.34中所示的氨基酸序列。
[0018] 8A6、GB3和2B6的⑶R的氨基酸序列之間的差異還可以被表示為在使用8A6的⑶R作 為參考序列時在本發明的抗體的CDR中所允許的同一性程度（以同一性百分比表示）。因此， 本發明的抗體的H-⑶R1優選地表征為與SEQ ID N0.20中所示的H-⑶R1具有60%或更多（諸 如70%、80%或90% )同一性。
[0019] 本發明的抗體的H-CDR2優選地表征為與SEQ ID如.21中所示的!《^2具有36% 或更多(諸如 40%、50%、60%、70%、80% 或 90%)同一性。
[0020] 本發明的抗體的H-CDR3優選地表征為與SEQ ID ^).22中所示的!1-〇)1?具有50% 或更多（諸如60%、70%、80%或90% )同一性。
[0021] 本發明的抗體的L-CDR1優選地表征為與SEQ ID ^).23中所示的1^-〇?1具有64% 或更多（諸如70%、80%或90% )同一性。
[0022] 本發明的抗體的L-CDR2優選地表征為與SEQ ID ^).24中所示的1^-〇?2具有29% 或更多（諸如 30%、40%、50%、60%、70%、80% 或 90%)同一性。
[0023] 本發明的抗體的L-CDR3優選地表征為與SEQ ID ^).25中所示的1^-〇?3具有78% 或更多(諸如80 %或90 % )同一性。
[0024]因此，本發明提供一種抗-Fey RIIB抗體，所述抗體在其重鏈可變區中包含與SEQ IDN0.20中所示的H-CDR1序列具有60%或更多同一性的H-CDR1序列，與SEQIDN0.21中所 示的H-CDR2序列具有36%或更多同一性的H-CDR2序列，與SEQ ID勵.22中所示的!1-〇)1?序 列具有50%或更多同一性的H-CDR3序列，與SEQ ID勵.23中所示的1^-〇)1?1序列具有64%或 更多同一性的L-⑶R1序列，與SEQ ID N0.24中所示的L-⑶R2序列具有29%或更多同一性的 L-CDR2序列，和與SEQ ID如.25中所示的1^-〇)1?3序列具有78%或更多同一性的1^-〇)1?3序 列。
[0025] 優選地，所述抗體在其重鏈和輕鏈可變區⑶R中仍然包含如SEQ ID N0s.29、30、31 (Η-CDR)和SEQ ID從^.32、33、34〇^-〇)1〇中所定義的"關鍵殘基"。
[0026] 優選地，相比于未經所述抗體處理的Daudi細胞，所述抗體使Daudi細胞的Fc γ RIIB的Ι??Μ磷酸化增強約4至10倍。
[0027] 本文所用術語"同一性百分比"是指在以如可得自www.clustal .org的ClustalW或 X技術或者等同技術所示例的最佳序列比對來比較兩個氨基酸序列時，序列內相應位置處 的相同氨基酸殘基的百分數。例如，在⑶R比對的情況下，SEQ ID NOs . 20-25中所示的每個 CDR(分別來自重鏈和輕鏈可變區）都分別作為重鏈或輕鏈可變區的目標CDR序列的參考序 列，例如SEQ ID N0.20的H-⑶R1與目標H-⑶R1比對。因此，比對兩個序列（參考序列和目標 序列），兩個序列之間相同的氨基酸殘基被識別，然后將相同氨基酸的總數分別除以SEQ ID 勵.20、21、22、23、24或25氨基酸的總數(氨基酸長度），具體取決于是比對!1-〇)1?1、!1-〇)1?2、 !1-〇?3、1^-〇01?1、1^-〇?2還是1^-〇)1?3。相除的結果是一個百分比值，即同一性百分比值/程 度。
[0028] SEQ ID NOs.14和20中所示的H-CDR1序列是SEQ ID勵.29中所示的!1-〇)1?1的優選 序列種類。
[0029] SEQ ID N0s.l5和21中所示的H-CDR2序列是SEQ ID勵.30中所示的!1-〇)1?2的優選 序列種類。
[0030] SEQ ID NOs.16和22中所示的H-CDR3序列是SEQ ID N0.31中所示的H-CDR3的優選 序列種類。
[0031] SEQ ID NOs.17和23中所示的L-CDR1序列是SEQ ID勵.32中所示的1^-〇?1的優選 序列種類。
[0032] SEQ ID N0s.l8和24中所示的L-CDR2序列是SEQ ID勵.33中所示的1^-〇?1的優選 序列種類。
[0033] SEQ ID N0s.l9和25中所示的L-CDR3序列是SEQ ID勵.34中所示的1^-〇?3的優選 序列種類。
[0034]因此，本發明提供一種抗-Fc γ RIIB抗體，優選為IgG型的抗-Fc γ RIIB抗體，所述 抗體
[0035] (a)在其重鏈可變區中包含SEQ ID N0s.l4、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和Η-CDR3,并且在其輕鏈可變區中包含SEQ ID N0s.l7、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3;或者
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