轉基因玉米ie034外源插入片段3’端旁側序列及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物生物技術領域，具體設及一種轉基因玉米IE034外源插入片段3' 端旁偵膊列及定性PCR檢測方法，W及用于檢測該序列的PCR引物、探針和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 玉米作為我國Ξ大糧食作物之一，播種面積和總產量均居第二位，在我國糧食安 全中發揮著重要的作用。近年來，國內玉米種植面積保持在5億畝W上，同時，每年還要進口 300萬-500萬噸的轉基因玉米彌補消費缺口。而隨著飼用玉米需求的剛性增長和近年來玉 米深加工業的快速發展，國內玉米消費還將持續增長。但是病蟲害、雜草、干旱、鹽堿等生物 或非生物脅迫嚴重影響了玉米生產。培育具有抗蟲、抗除草劑、抗病等性狀的轉基因玉米品 種并應用到實際生產中，能夠減少玉米產量損失，減少農藥化肥使用量。其中化蛋白的發現 掲開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。化殺蟲蛋白基因來源于蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis即化桿菌），是天然存在于±壤中的格蘭氏陽性菌，在其芽抱形成過程中產 生許多W結晶方式存在的蛋白質，運些蛋白質具有殺蟲活性，通常也被稱為化殺蟲蛋白。Bt 殺蟲蛋白按氨基酸序列的同源性可分為45大類313種，Crylle抗蟲基因屬于BT殺蟲蛋白家 族，是中國農業科學院植物保護研究所首次分離克隆出來的一種新的化y基因，隨后中國農 業科學院作物科學研究所將Crylle基因通過農桿菌介導法轉入到了中國玉米優良自交系 綜31基因組中，獲得了一個抗蟲轉基因玉米事件IE034,現已在進行環境釋放階段的安全評 價，對于未來國內日益高漲的玉米需求，該抗蟲玉米有可能進入商業化種植并推廣。
[0003] 轉基因玉米IE034已申請"農業轉基因生物安全評價證書"，因而其分子特征，包括 插入序列、插入位點及其相應的檢測方法都需要非常清晰，其中中國專利201210065919.X 提供了轉基因玉米事件IE034插入位點的外源5'端旁側DNA序列，該序列全長3^bp。但目前 尚不清楚轉基因玉米事件IE034插入位點的外源3'端旁側DNA序列，關鍵原因是3'端旁側序 列結構更為復雜，受體基因組序列和載體序列間或出現，需要更精準的實驗進行鑒定。因此 3'端旁側DNA序列及鑒定方法是轉基因玉米IE034安全管理不可或缺的部分。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供轉基因玉米事件IE034插入位點的外源插入片段的3'端旁側 DNA序列及其應用，W及用于檢測該序列的PCR引物、探針和試劑盒。
[0005] 為達到W上目的，本發明提供了轉基因玉米IE034外源插入片段3'端旁側DNA序 列，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或者為SEQ ID NO. 1所示序列的特異性片段。
[0006] 本發明還提供了所述DNA序列在檢測轉基因玉米中的應用。
[0007] 本發明還提供了用于檢測權利要求1所述的DNA的特異性PCR檢測引物及探針，所 述引物的核巧酸序列為：
[000引 上游引物：5 ' -CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3 '，
[0009]下游引物：5 ' -TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3 ' ；
[0010] 探針為：5 ' -F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3 '。
[0011] 可選的，在所述探針中，F為FAM、胎義、了61、如6、￥1。^116、〔73或切5;9為了日111拘、 Rox、Dabcy、Miq1或 Miq2。
[0012] 本發明還提供了一種轉基因玉米IE034的檢測試劑盒，所述試劑盒含有特異性PCR 檢測引物及探針，所述引物的核巧酸序列為：
[0013] 上游引物：5 '-CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3 '，
[0014] 下游引物：5'-了4了661'(：1'1'(：176(：1'1^6了6(：1'1'1'1'-3'；
[0015] 探針為：5 ' -F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3 '。
[0016] 可選的，在所述探針中，F為FAM、胎義、了61、如6、￥1。^116、〔73或切5;9為了日111拘、 Rox、Dabcy、Miq1或 Miq2。
[0017] 本發明還提供了一種轉基因玉米事件IE034的檢測方法，所述方法包括：W樣品總 DNA為模板利用本發明所提供的引物及探針進行實時巧光PCR擴增反應，檢測擴增反應產物 中是否具有SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[0018] 可選的，所述實時巧光PCR擴增的反應程序為:95°C10min;95°C15sec，60°C60sec 40個循環。
[0019]可選的，實時巧光PCR擴增的反應體系為： 2-GoldStar TaqMan Mixture 1 ΟμL 上游引物UOuM) 0.4μ1
[0020]下游引物（lOuM) 0 4μΙ 探針 OOuM) 0.4μ1 DNA模扳 2μΙ
[0021 ]加入滅菌蒸饋水至總體系為20μ1。
[0022] 本發明還提供了上述引物及探針在檢測轉基因玉米中的應用。
[0023] 本發明還提供了上述試劑盒在檢測轉基因玉米中的應用。
[0024] 本發明通過ΤΑ化-PCR擴增得到了抗蟲轉基因玉米事件ΙΕ034的3'旁側序列，并根 據該序列設計獲得特異性引物和探針，用于檢測轉基因玉米ΙΕ034。利用該方法，在實時巧 光PCR結束后即能判斷所檢測樣品中是否含有轉基因玉米ΙΕ034。本發明所提供的旁側序列 和引物適用于對轉基因玉米ΙΕ034(包括親本、雜種F1和后代)及其制品（包括植株、組織、種 子及其制品）的檢測。
【附圖說明】
[0025] 圖1為實施例1中Ξ輪反應的PCR產物電泳圖：
[00%]其中，圖1Α為第一輪PCR擴增產物，圖1Β為第二輪PCR擴增產物，圖1C為第Ξ輪PCR 擴增產物；
[0027] 圖2為轉基因玉米ΙΕ034實時巧光PCR檢測結果；
[0028] 圖3為靈敏度檢測擴增曲線。
【具體實施方式】
[0029] W下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW,Molecy lar cloning:a laboratoiy manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0030] 實施例1
[0031] 本實施例用于說明轉基因玉米IE034的外源插入片段3'端側翼序列的獲得。
[0032] 1.提取玉米種子基因組DNA。
[0033] 1.1樣品處理：
[0034] 取適量玉米種子（由中國農業科學院作物所王國英研究員提供轉基因玉米 "IE034" W及對照玉米"綜3Γ )在液氮速凍下經萊馳MM400冷凍研磨儀磨成粉末狀
[0035] 1.2玉米種子DNA提取：
[0036] 采用天根DP305-02植物基因組DNA提取試劑盒提取玉米種子基因組DNA，操作按產 品說明書進行。
[0037] 1.3 DNA檢測：
[0038] 取扣1提取的DNA溶液，W1 %的瓊脂糖凝膠電泳，根據其亮度和帶型來初步判斷提 取DNA的質量。最終采用ND-2000超微量核酸蛋白測定儀測定所提取的DNA的濃度和純度。
[0039] 2.通過TAIL-PCR方法獲得轉基因玉米外源基因整合位點3 '端側翼序列。
[0040] 2.1引物設計：
[0041 ]根據中國農業科學院作物所王國英研究員提供目的基因表達載體p3301UbiIe及 元件的結構，采用TAlX-PCR(the;rmal asymmetric interlaced PCR)技術，獲得轉基因玉米 外源基因整合位點3'端側翼序列并設計如下表1所示的引物序列：
[0042] 表1每輪TAIkPCR擴增的引物序列
[0043]
[0044] 2.2 TAIkPCRPCR擴增：
[0045] 每輪TAIkPCR包含Ξ輪PCR擴增，具體如下：
[0046] 第一輪PCR擴增，W轉基因玉米種子DNA為模板，用特異性引物SP F1-1和LAD1-1及 LAD1-2分別進行擴增；
[0047] 第二輪PCR擴增，將上述PCR產物稀釋40倍，取化1為模板，分別用SPF2-1+AC和 SPF2-2+AC進行擴增；
[004引第Ξ輪PCR，將上述PCR產物稀釋10倍，取化1為模板，用SP F3+AC進行擴增。