一種黃孢原毛平革菌木質素降解酶活力衰減后提高酶活的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種黃孢原毛平革菌木質素降解酶活力衰減后提尚酶活的方法。
【背景技術】
[0002]白腐真菌是一種高等絲狀真菌，在分類上大多數屬于擔子菌綱，生長在樹木或木材上，因引起木質白色腐爛而得名。白腐真菌降解木質素，是因為它能夠產生木質素降解酶，并分泌到細胞外。木質素降解酶對木質素的降解是以自由基為基礎的鏈反應過程，具有極強的氧化性和底物非特異性，這種降解機制使木質素降解酶不僅能夠降解木質素，還能夠降解環境中的許多異生物質和持久性有毒有機污染物(Barr&Aust, 1994 ； Cameron etal., 2000； Gao et al.，2010)。因此，白腐真菌及其木質素降解酶在環境污染控制及其生物修復等方面具有重要的應用價值。
[0003]黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是白腐真菌產生木質素降解酶和降解持久性有機污染物研究的模式菌種(Asgher et al.，2008; Singh&Chen，2008;Gaoet al.,2010)，屬非裙菌目(Phyllophorales)、伏革科(Corticiaceae)和顯革菌屬(Phanerochaete)。黃孢原毛平革菌木質素降解酶系統主要包括木質素過氧化物酶(LiP,ECl.11.1.14)、錳過氧化物酶(MnP ,ECl.11.1.13)和產H2O2的氧化酶。木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶是糖基化的含鐵的多種同功酶，木質素過氧化物酶能夠催化對非酚類木質素型式化合物和芳香族污染物的氧化，錳過氧化物酶能夠催化對木質素、木質素衍生物和很多酚類的木質素型式化合物的氧化。黃孢原毛平革菌木質素降解酶的合成受到多種營養和環境因素的復雜調節，木質素降解酶能夠在受到碳、氮或硫營養限制時激發產生，在高氧條件下表現活躍(Faison&Kirk, 1985;Dosoretz et al., 1990a；Michel et al., 1992；Singh&Chen，2008)。一般認為黃孢原毛平革菌不產生多功能過氧化物酶(versatile peroxidase)和漆酶。
[0004]—般地，黃孢原毛平革菌等白腐真菌在培養過程產生木質素降解酶，酶活在達到最高值后，迅速開始下降，酶活存在嚴重的不穩定現象，這是白腐真菌應用于實際污染物降解和木質素降解酶商業化生產所面臨的主要限制因素之一 (Singh&Chen2008)。木質素降解酶活力衰減的原因，可能包括兩個方面:一是白腐真菌乙二醛氧化酶等氧化酶所產生的存在于細胞外的H2O2對木質素降解酶具有損害作用;二是次級代謝階段產生的胞外蛋白酶對木質素降解酶具有水解作用(Dosoretz et al., 1990b , c ； Dass et al., 1995 ； X1ng etal.，2008)。目前，利用黃孢原毛平革菌產生木質素降解酶的研究，主要包括以下方面(Ikehata et al.,2004； Singh&Chen,2008): (I)發酵的營養條件(包括合適的碳源、氮源、微量元素、溶解氧和誘導物等)；(2)發酵的環境條件(如溫度、pH、攪拌和固定化條件等)；和
(3)反應器發酵放大的研究。至今，在黃孢原毛平革菌產生木質素降解酶的研究中，尚沒有見到能夠有效維持木質素降解酶高水平活力或在酶活衰減后重新提高酶活的方法，木質素降解酶的穩定產生仍是白腐真菌和木質素降解酶實際應用所需解決的主要瓶頸問題。
[0005]碳限制培養是白腐真菌木質素降解酶尤其是木質素過氧化物酶產生的基本培養方式之一。因此，實現在碳限制培養條件下木質素降解酶的穩定產生具有重要的意義。

【發明內容】

[0006]本發明的一個目的是提供一種使黃孢原毛平革菌產生的木質素降解酶活力在衰減后再次提高的方法。
[0007]本發明提供的方法，包括如下步驟:碳限制培養基中發酵黃孢原毛平革菌，在發酵體系中的碳源耗盡時補加碳源，實現使所述黃孢原毛平革菌產生的木質素降解酶活力在衰減后再次提尚。
[0008]上述方法中，所述碳源為葡萄糖；
[0009]所述補加葡萄糖的量為使發酵體系中的葡萄糖濃度為2_5g/L。
[0010]上述方法中，所述補加碳源的次數為2-3次。
[0011]上述方法中，所述在發酵體系中的碳源耗盡時補加葡萄糖為如下I)或2):
[0012]1)、在發酵培養第3天向發酵體系中補加葡萄糖，使所述發酵體系中的葡萄糖濃度為2g/L ；且在發酵培養第5天向發酵體系中補加葡萄糖，使所述發酵體系中的葡萄糖濃度為2g/L;
[0013]2)、在發酵培養第3天向發酵體系中補加葡萄糖，使所述發酵體系中的葡萄糖濃度為5g/L ；且在發酵培養第6天向發酵體系中補加葡萄糖，使所述發酵體系中的葡萄糖濃度為5g/Lo
[0014]上述方法中，所述碳限制培養基為將固定化培養載體加入碳限制液體培養基中，且使其堆積高度高于液體培養基液面，處于非浸沒狀態，得到的培養基;所述固定化培養載體在所述碳限制培養基中的濃度為I.6g/100mL；
[0015]每IL所述碳限制培養基由終濃度為5.04g//L葡萄糖、終濃度為4.05g//L酒石酸銨、終濃度為2.0g/L KH2P04、終濃度為0.5g/L MgS(k、終濃度為0.lg/L CaCl2、終濃度為lmg/L維生素B1、終濃度為1.5mM藜蘆醇、pH 4.4且終濃度為20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液和70mL/L微量元素溶液組成；
[0016]所述微量元素溶液由終濃度為3g/L MgS(k、終濃度為0.5g/L MnSO4、終濃度為1.0g/L NaCl、終濃度為 0.1g/L FeSO4.7H20、終濃度為 0.lg/L CoCl2、終濃度為 0.lg/LZnSO4.7出0、終濃度為0.18/1 CuS(k、終濃度為 10mg/L AlK(SO4)2.12H20、終濃度為 10mg/LΗ3Β03、終濃度為10mg/L Na2MoO4.2H20、終濃度為1.5g/L次氮基三乙酸鹽和水組成。
[0017]上述方法中，所述發酵為將黃孢原毛平革菌孢子接入所述碳限制培養基中得到發酵體系，培養;所述發酵體系中的黃孢原毛平革菌孢子含量為1.0 X 15-1.0 X 19個孢子/
mLo
[0018]上述方法中，所述培養的溫度為35-39°C，所述培養的轉速為140-170rpm。
[0019]上述方法中，所述木質素降解酶為木質素過氧化物酶或錳過氧化物酶。
[0020]上述的方法在生產木質素降解酶或提高木質素降解酶活力中的應用也是本發明保護的范圍。
[0021]本發明另一個目的是提供一種黃孢原毛平革菌生產木質素降解酶的方法。
[0022]本發明提供的方法，包括上述的方法的步驟。
[0023]本發明的使用證明，本發明在空氣環境下(不補充純氧)，對固定化黃孢原毛平革菌進行碳限制培養，發酵產生木質素降解酶，在葡萄糖耗盡后，通過向培養體系補加葡萄糖的策略，實現了木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶活力在衰減后的重新提高。這種木質素降解酶活力恢復技術，僅需在培養體系中適量補加葡萄糖，即可實現木質素降解酶酶活的恢復，條件控制簡單，對實現黃孢原毛平革菌木質素降解酶的穩定生產和白腐真菌的實際降解應用具有重要的參考意義。
【附圖說明】
[0024]圖1為葡萄糖補料對黃孢原毛平革菌在碳限制培養過程木質素過氧化物酶產生的影響。
[0025]圖2為葡萄糖補料對黃孢原毛平革菌在碳限制培養過程錳過氧化物酶產生的影響。
[0026]圖3為葡萄糖補料作用下黃孢原毛平革菌在碳限制培養過程葡萄糖的消耗。
【具體實施方式】
[0027]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0028]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0029]下述實施例中黃孢原毛平革菌BKM-F-1767孢子記載在如下文獻中:Tien，M.，Kirk ,T.K.Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium.Methods