轉錄因子gata3調控雞腸道內糖轉運蛋白sglt1和glut5表達的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及轉錄因子GATA3調控雞腸 道內糖轉運蛋白SGLT1和GLUT5表達的方法。
【背景技術】
[0002] 單糖是動物生長發育不可或缺的營養物質。主要由糖異生途徑產生，腸道也吸收 一部分外源的單糖。飲食中可溶性的碳水化合物在腸道中經消化最終分解成為葡萄糖、果 糖和半乳糖等單糖。糖類作為機體內的主要能源物質，在機體的代謝和內環境穩態等方面 都有著至關重要的影響。因此，研究腸道糖類吸收機制對動物的營養與健康都具有重要意 義，是國內外研究的熱點。動物細胞膜的糖轉運載體主要分為兩大家族，一類為鈉離子依賴 性單糖轉運載體（SodiumDependentGlucoseTransporter,SGLTs)，其在單糖的轉運過 程中要消耗能量；另一類為易化性單糖轉運載體(FacilitatedGlucoseTransporter， GLUTs)，其轉運單糖的過程不消耗能量。它們是腸道吸收糖類的重要載體。
[0003]鈉離子依賴性單糖轉運載體蛋白SGLT1對腸上皮細胞中營養、液體和電解質的轉 運起重要作用。不同物種的SGLT1具有較高的同源性，大小為662-665個氨基酸。Gal-Garber 研究發現雞SGLT1的氨基酸序列與人、綿羊和鼠等具有高度的同源性，84%-88%氨基酸殘基 相同。而Turk等則發現SGLT1的二級結構是由14個跨膜的α螺旋組成，主要為MS1-MS14。更有 研究發現其羧基端對辨認葡萄糖起關鍵作用。在動物和細菌細胞中發現200多個SGLT家族 成員，在組織中從上皮細胞到中樞神經系統有11個人類基因表達。SGLT1是一種糖基化蛋 白，具有高度親和力，主要在小腸黏膜表達，它是SGLT家族中是最基礎的基因，也是研究最 多最徹底的基因。轉運載體SGLT1是以細胞內外Na+濃度差為驅動力，然后在腸道逆濃度梯 度吸收葡萄糖。有研究表明這種轉運機制是主要通過刷狀緣膜進行轉運葡萄糖和半乳糖 的，該轉運蛋白還可以轉運碘、氨基酸、泛酸等底物。Dyer等研究發現小腸黏膜上皮中SGLT1 表達量與小腸對單糖的吸收能力呈正相關。據報道70%小腸切除后，剩余小腸中SGLTlmRNA 的表達量與正常小腸相比增長三倍以上。現已證實，大多數物種中，飲食含有的碳水化合物 能調控腸道SGLT1的水平和活性。
[0004]GLUT5是易化性單糖轉運載體家族的成員，是主要的糖轉運蛋白。GLUT5在腎臟和 小腸中都顯著表達，廣泛分布于腸上皮細胞刷狀緣和基底膜，作用主要為參與腸道果糖的 轉運。轉運機制主要是以易化擴散的方式順果糖濃度梯度從細胞外將果糖轉運到細胞內， 在轉運糖類的過程中不需要消耗能量。GLUT5是低親和力高容量的轉運蛋白，對果糖的吸收 具有特異性和必要性。據報道GLUT5在小腸上皮細胞中的表達為高水平。在具有肥胖癥和代 謝疾病的動物腸道中，GLUT5表達可能會受到影響。但GLUT5對這些疾病的影響存在許多爭 議。Noguchi等研究發現飲食中糖類經消化得到的果糖等糖類能促進小腸在糖酵解過程提 高丙酮酸羧激酶等關鍵酶基因的轉錄水平，但葡萄糖無此功能。因此，與小腸中葡萄糖的代 謝速度相比，果糖代謝的速度比較快。在小腸GLUT5基因的轉錄起始位點上游含有一個TATA 盒，在此盒的尾側有一個同類盒基因CdxA，它主要負責著腸道上皮的分化，而且在其上游處 還含有一處稱為上游刺激因子(USF)的片段，該片段為碳水化合物的反應元件。提示CdxA與 USF都和小腸GLUT5基因的表達有著密不可分的聯系，而且對果糖濃度的變化也很敏感。
[0005] 糖類轉運載體蛋白SGLT1和GLUT5對小腸上皮細胞吸收單糖的機制起著至關重要 的作用，其基因的表達和調控，以及蛋白合成等發生異常均可能引起糖類轉運載體在數量 及功能上的各種異常，導致機體出現各種病理變化。糖類轉運載體數量的變化可能改變上 皮細胞基底膜的運輸能力，如葡萄糖轉運過程中改善膳食中碳水化合物的吸收。目前對于 這兩種糖類轉運載體的具體機制還有待更進一步的研究。
[0006] GATA家族屬于鋅指總科，其成員在不同生物體中是高度保守的。普遍位于啟動子、 轉錄起始部位的上游或者接近啟動子的部位、增強子、位點控制區等部位。GATA轉錄因子是 一個在結構上與DNA結合蛋白相關的家族，其也對哺乳動物紅細胞的生成起到調控作用，在 真菌、果蠅和線蟲中都有相同的功能同源性。脊椎動物中的GATA轉錄因子可細分為兩個功 能組，其中GATA1、GATA2、GATA3主要在造血干細胞和神經元細胞中表達，調控胸腺細胞、紅 細胞、巨核細胞和神經元細胞的分化;而GATA4、GATA5、GATA6主要在組織的內胚層和中胚層 中表達，參與了肺、肝、腸、性腺的發育和功能。GATA家族成員都包含一個或兩個鋅指基序 CXNCXnCNXC的結構域，可以結合到基因啟動子的一個共同的DNA序列(A/T)GATA(A/G)，直接 激活或抑制目的基因的表達，但激活域和組織分布各不相同。在線蟲中已確定了多種GATA 轉錄因子，它們影響基因參與腸道、真皮和神經組織發育中的細胞迀移、融合等活動。
[0007]GATA3是GATA鋅指轉錄因子家族的一名成員，具有高度保守的C4型鋅指結構域，它 在控制細胞的發育、增殖及分化等方面起著重要的作用。GATA3存在于活性的T細胞、胚胎期 的大腦和腎臟中。小鼠GATA3基因CDS區長度為1332bp，編碼443個氨基酸，而人GATA3基因 CDS區長度為1335bp，編碼444個氨基酸，雞GATA3基因CDS區長度也為1335bp，編碼444個氨 基酸。GATA3含有N-端激活域和兩個鋅指結構，即為N-端鋅指結構和C-端鋅指結構。C-端鋅 指結構對于DNA的綁定是必不可少的，然而N-端鋅指結構能穩固這個綁定，且能與GATA的協 同蛋白（F0G)等其它鋅指蛋白相互作用。N-端鋅指結構和C-端鋅指結構在IL-4，IL-13和IL-5的感應中起著不同的作用。Linda等研究發現脊椎動物中GATA-3轉錄因子含有幾乎完全相 同的DNA序列、識別特性、基本氨基酸序列及mRNA表達特點，還可刺激T淋巴細胞中的特定基 因的表達以及雞、小鼠和人類大腦的發育。脊椎動物中GATA家族成員的表達差異可能是由 于其與特定細胞協同作用導致的。組織特異性基因的表達受到轉錄因子的調控，而這些轉 錄因子將結合到特定的DNA序列上發揮各自的調控作用。
[0008]GATA3首次被克隆作為一種特異性T細胞的轉錄物，是T細胞發育所必需的轉錄因 子，能調節T細胞的增殖和分化。GATA3的功能在T細胞的發育中得到廣泛應用，參與胸腺細 胞發育的各個方面。生殖細胞中GATA3的缺失會導致胎死，這主要是由于大量的表型異常， 包括生長遲緩，大腦和脊髓的嚴重畸形，還有胎兒肝臟造血作用的總畸變。研究發現GATA3 調節乳腺上皮細胞的分化，是乳腺上皮細胞中高純度的轉錄因子，在細胞生物學中起著很 重要的作用。GATA3已被證明能夠促進Th2細胞分泌IL-4，IL-5和IL-13,誘導ThO細胞分化為 T細胞亞型，但是抑制ThO細胞分化為Thl細胞。GATA蛋白具有高度保守性，從細菌到人類均 表達，說明GATA蛋白在細胞的發育和分化中起著重要作用。GATA3在皮膚發育中也扮演著重 要的角色，尤其是在特定內根鞘細胞與毛干細胞的分化過程中具有重要作用。內皮細胞表 型在時間和空間上收到轉錄和轉錄后高度調控。GATA3在皮膚和毛囊的發育中起著重要作 用。在皮膚里，上皮細胞經過一個向上分化過程產生不同毛發卵泡家系，如髓質、發根的皮 層和表皮和內根外殼。GATA3在造血組織(如:T細胞)或腎臟、中樞神經系統、皮膚和乳腺等 非造血組織中都表達。GATA3可調控基因的表達，能改變從細胞質到細胞核進入目的基因的 位置，GATA3包含一個經典細胞核輸入信號。由于GATA3可以在多種組織中表達，所以GATA3 的表達是至關重要的。例如，腎小管中GATA3的失活會導致輸尿管的異常發育和一系列泌尿 生殖器的畸形。它與其他蛋白互作作用有助于GATA3對細胞特異性目標的調控和改變GATA3 的功能。盡管GATA3在腸上皮細胞中表達，但GATA3轉錄因子在腸上皮細胞中的功能和調控 機制了解卻很少，有待進一步研究。

【發明內容】

[0009] 本發明的目的在于提供轉錄因子GATA3調控雞腸道內糖轉運蛋白SGLT1和GLUT5表 達的方法。
[0010] 本發明由如下技術方案實現的：一種轉錄因子GATA3調控雞腸道內糖轉運蛋白 SGLT1和GLUT5表達的方法，首先對雞小腸上皮細胞的體外分離培養及鑒定，獲得培養細胞， 然后利用生物信息學軟件尋找SGLT1和GLUT5基因5'上游GATA3基因的結合位點，構建轉錄 因子GATA3的真核表達載體pcDNA3.1-GATA3,運用脂質體轉染法將構建的真核表達載體 pcDNA3.1-GATA3轉染雞小腸上皮細胞，轉染后收集雞小腸上皮細胞并獲得cDNA，最后利用 實時熒光定量PCR檢測cDNA中目的基因GATA3、SGLT1和GLUT5的絕對表達量。
[0011] 具體包括如下步驟： 1. 對雞小腸上皮細胞的體外分離培養及鑒定:取15日齡的雞胚，無菌操作取出小腸，去 除腸系膜分離小腸并清洗干凈小腸組織塊;采用嗜熱菌蛋白酶HEPES消化液進行酶消化組 織塊，使其形成細胞懸液，采用相差貼壁法培養雞小腸上皮細胞，培養好雞小腸上皮細胞接 種于細胞培養板，至于40°C7%C02培養箱內培養;將培養好的雞小腸上皮細胞采用倒置相 差顯微鏡進行形態學鑒定，通過免疫組化進行細胞鑒定，獲得培養細胞； 2. 構建轉錄因子GATA3的真核表達載體pcDNA3.1-GATA3: A. 引物設計:NCBI中查找雞轉錄因子GATA3的基因序列信息，按查到的基因序列應用 Primer3.0進行在線引物設計，所設計的引物為GATA3基因PCR克隆引物和GATA3基因熒光定 量PCR引物，引物信息見表1; 表1PCR引物
B.PCR擴增相應的基因片段:使用表1中引物對GATA3基因片段進行PCR擴增反應， C. 純化回收的PCR產物進行連接轉化，制備真核表達載體pcDNA3.1-GATA3:通過凝 膠電泳，對PCR產物的進行割膠回收，純化得到的PCR產物連接轉化至DH5a感受態細胞，菌體 擴大培養，培養好的菌液進行PCR測序鑒定，測序正確的菌液提取GATA3質粒，獲得真核表達 載體pcDNA3.1-GATA3; 3.絕對熒光定量PCR反應體系的建立:測序正確的菌液提取GATA3質粒，用微量核酸和 蛋白測定儀測定質粒DNA的濃度和純度，利