可用于檢測與喉癌相關的esrrg基因啟動子區甲基化程度的試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種輔助診斷喉癌的檢測試劑盒，尤其是涉及一種可用于檢測與喉癌 相關的基因啟動子區甲基化程度的試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 喉癌（Laryngeal carcinoma，LC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其發病率在我國 北方地區位于頭頸部惡性腫瘤的第一位，在我國南方地區，僅次于鼻咽癌居于第二位：在世 界范圍內，居于全身惡性腫瘤的第十一位，約占全球每年新發惡性腫瘤的1-2. 5%，其中喉鱗 狀細胞癌約占90%。目前研究表明喉癌的發生發展與生活習慣、環境因素、遺傳和表觀遺傳 學等多種復雜的因素相關。近年來，隨著人們生活水平的提高，環境因素惡化等影響，我國 喉癌的發病率和死亡率增長迅速，而且發病年齡明顯提前。由于喉癌的早期癥狀不明顯，病 理學活檢是其診斷的金標準，確診時患者多數已進入中、晚期，許多患者在疾病發生的早期 沒有得到及時的診斷和治療，對喉癌的治療和預后帶來了極差的影響。盡管近幾十年來外 科技術和輔助治療得到不同程度的提高，但是目前喉癌的五年生存率仍未明顯增長，原因 之一就是目前喉癌發病的分子學機制仍不清楚，早期診斷及治療不理想。因此，有必要探索 具有高敏感性和特異性的分子檢測指標，對喉癌患者做到早發現，早診斷，早治療，提高喉 癌患者總體生存率。
[0003] 雌激素相關受體伽馬（estrogen-related receptor gamma，方57況6)是雌激素 相關受體（Estrogen-related receptors，家族中的一員，定位于染色體lq41 (chrl:216)，cDNA全長3. Okb，編碼一條長458氨基酸多肽鏈。因其尚 未發現天然配體，故也稱為孤核受體。雌激素相關受體可通過兩個鋅指結構組成的DNA結 合域，和其它轉錄因子之間相互作用或結合DNA序列上的反應元件，調控多種基因的轉錄， 參與細胞增殖、分化、凋亡、胞內信號傳導、核內信號信息的交流等過程。最近國內外的一些 研究表明，通過上調雌激素相關受體伽馬的表達可增加 E-鈣黏蛋白表達，繼而促進間質向 上皮轉化，并在體內抑制乳腺癌的生長。同樣，將雌激素相關受體伽馬基因前體進轉染入前 列腺癌細胞系LnCaP和DU145,可在體外顯著抑制腫瘤增殖和在體內抑制腫瘤形成，表明 雌激素相關受體伽馬（estrogen-related receptor gamma，j5157?y?ii)在多種腫瘤中起到抑癌 基因的作用。但是目前，國內外還沒有公開任何關于在喉癌中用于檢測雌激素相關受體伽 馬基因啟動子區甲基化程度的檢測試劑盒相關研究報道。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測方便、針對性強、檢測準確率高的 可用于檢測與喉癌相關的方5^6基因啟動子區甲基化程度的試劑盒及其應用，其中基因 方5^^甲基化水平與喉癌的患病率呈正相關，可通過對樣品DNA甲基化水平測定輔助診斷 喉癌。
[0005] 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種可用于檢測與喉癌相關的 基因啟動子區甲基化程度的試劑盒，包括基因啟動子區的甲基化特異性擴增 上游引物、下游引物及其甲基化特異性測序引物，其中所述的甲基化特異性擴增上游引物 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' -TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG-3' ； 所述的甲基化特異性擴增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' -Biotin -TCTTTTCAAATCCATCACTAA -3' ； 所述的甲基化特異性測序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示： 5' -GGGAGATGAATTGGG _3'。
[0006] 上述可用于檢測與喉癌相關的方5児?6基因啟動子區甲基化程度的試劑盒的應用， 該試劑盒可用于喉癌輔助檢測、診斷或藥物治療中。
[0007] 與現有技術相比，本發明的優點在于：本發明首次公開了可用于檢測與喉癌相關 的方5^6基因啟動子區甲基化程度的試劑盒及其應用，所述的檢測試劑盒包含雌激素相關 受體伽馬基因啟動子區的甲基化特異性上游引物、甲基化特異性下游引物及其甲基化特異 性測序引物。雌激素相關受體伽馬基因啟動子區域的高甲基化，影響轉錄因子與DNA間的 相互作用，或改變染色質結構從而導致雌激素相關受體伽馬基因的低表達，從而影響喉癌 的發生和發展。因此，雌激素相關受體伽馬基因啟動子區甲基化水平與喉癌的患病率呈正 相關，通過檢測雌激素相關受體伽馬基因啟動子區甲基化程度輔助診斷喉癌，簡單、方便， 檢測效率高，針對性強，具有準確可靠、靈活快速和經濟節約的優點，有利于喉癌的早期發 現和及時治療。
[0008] 綜上所述，以基因處冗你啟動子區域甲基化水平為基礎的診斷試劑盒可以方便快 捷地在分子水平上實現對喉癌的檢測，同時，以處冗你基因啟動子區域DNA甲基化為靶點的 藥物有望成為喉癌輔助診斷、檢測和篩選的一種新手段。
【附圖說明】
[0009] 圖1為被檢測序列所在區域(具體位置為chrl: 217)，以及所檢 測的6個CpG點之間的關聯性分析結果(例如CpGl與CpG2的相關系數為0. 891，CpG2與 CpG3的相關系數為0.942); 圖2為DNA甲基化水平檢測結果示意圖（如圖示CpGl到CpG6的甲基化程度分別為66%， 64%，61%，61%，65%，66%);圖中陰影部分顯示的是對應CpG位點的信號強度，結合該位點附近 堿基種類可分析得到其甲基化水平（即陰影框對應的上方數字)。
【具體實施方式】
[0010] 以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。 具體實施例
[0011] 1、研究對象的收集 本研究選取寧波市某三甲醫院手術切除的喉癌患者93例手術標本作為研究對象。所 有病例診斷，依據患者的臨床資料、影像學和纖維喉鏡鏡檢查等，并得到術后病理診斷確 認。手術切除喉癌組織和癌旁組織(距離癌組織至少5cm以上的正常組織)立即保存于-80 度液氮，用于日后組織標本全基因組DNA提取。所有研究對象都簽署知情同意書。
[0012] 2、基因組DNA的提取 采用QIAamp DNAMini Kit (Qiagen, Hilden,德國）DNA提取試劑盒提取組織全基因 組DNA，再通過NanoDrop2000超微量分光光度計（美國，Thermo Fisher Scientific)檢測 所得DNA的濃度，以供處冗你基因啟動子區DNA甲基化水平的檢測。
[0013] 3、DNA甲基化水平測定 本實驗采用焦磷酸測序技術對方5^6基因啟動子區的6個CpG位點（如圖1)進行了 DNA甲基化水平分析。此技術的基本原理：用重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應用聚合酶鏈 反應（PCR)擴增，可