發酵方法
【專利說明】發酵方法 發明領域
[0001] 本發明涉及用于生產二羧酸的方法。
[0002] 發明背景
[0003] 二羧酸（例如蘋果酸、富馬酸和琥珀酸）是重要的化合物，其在食品工業中用于食 物制備和保存，在醫藥工業中用于配制醫藥制品，以及用于（生物）聚合物中的構建單元和 其他工業用途。為了滿足對二羧酸的日益增加的需要，正在開發更高效和更具成本效益的 生產方法。
[0004] 已知一些生產二羧酸的方法。傳統上，通過在中性pH下發酵細菌來制造二羧酸， 這例如描述于US 5, 573, 931中。另外，其它微生物如酵母已被用于在低pH下生產二羧酸， 其優點為直接生產酸（W02010/003728)。
[0005] 為了實現經濟上可行的方法，需要快速高效地生產二羧酸。所需效率設置了發酵 方法中可使用的生物質的量的上限。這影響了生產力，其正是目前的方法所遭遇的問題。這 可通過重復利用生物質從而允許較高的生物質濃度來解決。這種提高發酵速率的技術在許 多應用如乙醇生產（Cyzewski等人，1977)中被充分描述。
[0006] 然而，對于二羧酸的生產，在第二發酵運行中觀察到了對固有活性的負面影響。這 意味著：大部分重復利用的生物質不再生產，從而阻礙整合了細胞再循環的方法的實施。
[0007] 本公開旨在提供經改進的發酵生產二羧酸的方法，當用于上述發酵中時，所述方 法克服了不產出性（non-productive)生物質的缺點。
[0008] 發明簡沐
[0009] 本發明涉及一種生產二羧酸的方法。所述方法包括在容器（vessel)中發酵真菌 菌株，所述容器包含合適的發酵培養基。進行所述方法的方式使得至少部分細胞被重復利 用（即，再循環）。細胞可被再循環回原始容器或者再循環入第二容器。關鍵地，部分真菌 細胞的重復利用在維生素和/或微量元素的存在下進行。
[0010] 在經由真菌菌株發酵的標準二羧酸生產期間，通常會看到比生產力（QP)的降低。 類似地，在相同培養基中生長的再循環細胞也展示出比生產力（QP)的降低。然而，出乎意 料地，我們已發現：當進行重復利用時向培養基補充維生素和微量元素導致QP被完全恢 復，達到了與初始發酵中相同的水平。可觀察到較高的KPi :qp降低和較高Yps。
[0011] 因此，根據本發明，提供了用于制備二羧酸的方法，所述方法包括在包含合適發酵 培養基的容器中發酵真菌細胞，其中在維生素和/或微量元素的存在下重復利用至少部分 真菌細胞。 附圖簡介
[0012] 圖1顯示了不同細胞再循環之前和之后的琥珀酸生產力（按照生物質歸一化）。
[0013] 圖2顯示了具有不同起始生物質濃度的再循環培養中琥珀酸濃度的演變。
[0014] 圖3顯示了培養基組成對再循環培養的影響的表征。生產培養被用作參照。A.所 產生琥珀酸的量；B.達到的KPI。
[0015] 圖4顯示了各發酵的KPI值及其累計值（即，考慮到之前運行的發酵）的比較。
[0016] 發明詳沐
[0017] 在本說明書和附屬權利要求的通篇，詞語"包括"、"包含"和"具有"應被解釋為包 含性的。換言之，在語境允許的情況下，這些詞語意圖傳達的意思是：可以包括其它沒有明 確列舉的要素或整體。
[0018] 本文中不使用數量詞修飾時指的是一個/種或多于一個/種（即一個/種或至少 一個/種）語法對象。例如，"要素"可意味著一個/種要素或多于一個/種要素。
[0019] 本發明涉及一種用于生產二羧酸的方法。術語"二羧酸"和"二羧酸根 (dicarboxylate) "（例如"琥珀酸或蘋果酸"和"琥珀酸根和蘋果酸根"）在本文中具有相 同含義并可交換使用，前者是后者的氫化形式。
[0020] 在所述方法中，在包含合適發酵培養基的容器中發酵真菌細胞。本文所使用的術 語發酵指的是化合物的微生物生產，在此處是由碳水化合物生產二羧酸。
[0021] 優選地，發酵產物是二羧酸，優選地蘋果酸、富馬酸或琥珀酸或己二酸，優選地琥 珀酸。
[0022] 用于生產發酵產品的方法的一些優選實施方式在本文中被進一步限定為用于生 產二羧酸的方法。
[0023] 關鍵地，在本發明中，在維生素和/或微量元素的存在下，發酵中使用的至少部分 真菌細胞被重復利用，即一部分真菌細胞被再循環。
[0024] 本發明涉及一種用于生產二羧酸的方法。所述方法包括在容器中發酵真菌菌株， 所述容器包含合適的發酵培養基。進行所述方法的方式使得至少部分細胞被重復利用。細 胞可被再循環回原始容器或者再循環入第二容器。關鍵地，真菌細胞的重復利用在維生素 和/或微量元素的存在下進行。
[0025] 為了本發明目的，維生素是生物體（在這種情況下是真菌菌株）以有限的量需要 的作為重要營養物的有機化合物。當有機化學化合物（或相關的化合物組）不能被生物體 (真菌菌株）足量合成時，其可被視為維生素。
[0026] 用于本發明中的維生素通常是維生素B(或者形成維生素B復合物或維生素 等）。適用于本發明中的維生素 B的實例包括維生素 B1例如硫胺素、維生素 B 2(例如核 黃素）、維生素 B3(例如煙酸或煙酰胺）、維生素 B5(例如泛酸）、維生素 B6(例如吡哆醇 (pyroxidinem)、吡哆醛或吡哆胺或鹽酸吡哆醇）、維生素 B7 (例如生物素）、維生素 B8 (例如 肌醇）、維生素 B9 (例如葉酸）、維生素 B12 (例如各種鈷胺素，例如氰鈷胺素）或維生素 Bx (例 如對氨基苯甲酸）。在根據本發明的細胞重新利用中，可使用這些維生素中的任一種或其混 合物。
[0027] 本發明中使用的維生素的平均濃度通常低于百萬分之1000(以原子計數測量）或 者低于1000 μ g/g。本發明中使用的維生素的平均濃度通常為至少約百萬分之1 (以原子計 數測量）或者至少約1 μ g/g。
[0028] 為了本發明目的，微量元素是生物體（在這種情況下是真菌菌株）的恰當生長、發 育和生理僅以極少量需要的礦物質。在本文中，微量元素是除了普通有機分子中存在的碳、 氫、氮和氧這四種元素之外，有生命的生物體（在這種情況下是真菌菌株）所需的化學元 素。
[0029] 通常，微量元素不是可以被視為大量營養素或大量礦物質的化學元素。被視為大 量營養素的化學元素是生物體通常大量消耗的那些，即，碳、氫、氮、氧、磷和硫。鈣、鹽（鈉 和氯、鎂和鉀（連同磷和硫）可被添加到大量營養素的列表中，因為相較于其它維生素和元 素，它們被大量需要。
[0030] 因此，可被視為微量元素的元素可包括鐵、鈷、銅、鋅、鉬、碘、硒、硼、鉻、砷和硅。然 而，為了本發明的目的，大量營養素可被視為微量元素。在根據本發明的細胞重新利用中， 可使用任一種微量元素或任何這些微量元素的任意混合物。
[0031] 本發明中使用的微量元素的平均濃度通常低于百萬分之1000(以原子計數測量） 或者低于1000 μ g/g。本發明中使用的維生素的平均濃度通常為至少約百萬分之1 (以原子 計數測量）或者至少約1 μ g/g。
[0032] 在所述方法中，來自發酵的細胞被取出并重復利用，即，它們被再循環。這表示：它 們被重新引入同一發酵容器中和/或引入第二發酵容器（含合適的發酵培養基）中。然而， 在每種情況下，重復利用均在維生素和/或微量元素的存在下進行。也就是說，當真菌細胞 被重復利用時，向發酵培養基補充維生素和/或微量元素。
[0033] 如上所述，本發明的方法包括在維生素和/或微量元素的存在下進行的細胞重復 利用。換言之，向引入再循環細胞的發酵培養基中補充維生素和/或微量元素。通常，向發 酵培養基中補充維生素和微量元素的混合物。
[0034] 引入再循環細胞的培養基通常至少允許再循環細胞的一些生長。引入再循環細胞 的培養基可包含氮源，例如銨。還可優選地的是加入額外的鐵源。
[0035] 可進行多個再循環/再循環步驟。例如根據本發明所述方法的生產二羧酸的方法 中可使用2個、3個、4個、5個或更多個再循環步驟。
[0036] 本領域技術人員可確定再循環步驟中合適的接種濃度。合適的接種濃度可以為 從約l〇g/L至約50g/L，例如約15g/L至約20g/L。合適的接種濃度可以與生產培養物 (production culture)中的最終生物質濃度大致相同。
[0037] 根據本發明的生產二羧酸的方法可以以任何合適的模式（例如，分批模式、補料 分批模式、連續模式或這些發酵模式的任意合適組合）進行。優選地，根據本發明的生產二 羧酸的方法以補料分批模式或連續模式進行。
[0038] 以所有這些發酵模式進行細胞再循環的方法是本領域技術人員眾所周知的。
[0039] 基于從產物流中分離細胞的位置，重復利用細胞的方法可彼此不同。
[0040] 這種生物質分離可發生在發酵容器外部或內部。如果細胞分離發生在發酵容器 外部，那么這可通過重力（例如，離心或傾析）或通過機械力（例如，過濾技術）來實現。 如果細胞分離發生在發酵容器內部，那么這可通過例如以下進行：細胞沉降（settling)或 (自）凝聚，然后可除去清澈的上層并重復利用剩余細胞。
[0041] 分批發酵在本文中被定義為這樣的發酵，其中所有營養物在發酵開始時加入。
[0042] 補料分批發酵是這樣的分批發酵，其中營養物在發酵期間加入。分批和補料分批 發酵中的產物可在合適的時機收獲，例如在一種或更多種營養物耗盡時收獲。
[0043] 連續發酵是這樣的發酵，其中營養物被連續加入到發酵中且其中產物被連續地移 出發酵。
[0044] 在一個實施方式中，在本發明的方法中發酵酵母是在碳水化合物限制條件下進行 的。當在本文中使用時，碳水化合物限制條件被定義為維持碳水化合物濃度低于l〇g/l，例 如約5g/l。<