粘滑白蟻球菌TSB47、木聚糖酶TmXyn1及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及粘滑白蟻球菌TSB47、木聚糖酶TmXynl及其 編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 木質纖維素是自然界最豐富的生物質資源，對其進行綜合利用對人類社會的可持 續發展具有重要意義。在自然界能降解木質纖維素的微生物主要是一些真菌和細菌，對運 些微生物資源的挖掘將有助于對生物質的開發與利用。木質纖維素由纖維素、半纖維素和 木質素運Ξ種高分子化合物組成，在自然界能穩定存在。降解木質纖維素需要一系列復雜 酶系中多種酶的相互作用。能降解木質纖維素的微生物均含有豐富的纖維素酶、半纖維素 酶等，因此，從自然環境中篩選纖維素降解菌，將具有良好的開發與應用前景。
[0003] 木聚糖在半纖維素中含量豐富，結構要比纖維素復雜，完全降解木聚糖需要多種 水解酶（即木聚糖降解酶系統）的協同作用。木聚糖酶巧.C3. 2. 1. 8)是一類W內切方式 降解木聚糖分子中β-1，4-木糖巧鍵的酶系。內切-β-1，4-木聚糖酶是木聚糖降解的主要 作用酶，它與β-木糖巧酶共同作用可W使木聚糖降解為木糖或者木聚寡糖。近年來，木聚 糖酶在食品、紡織、飼料、能源工業中都顯示了廣闊的應用前景。在仔豬飼料中添加含有木 聚糖酶的復合酶制劑能夠提高干物質、粗蛋白質粗纖維等的表觀消化率W及降低糞便中大 腸桿菌數和腹瀉率。在造紙工業中，應用半纖維素酶進行預漂、助漂，可W降低化學藥品的 使用量，已經成為一種較為成熟的工藝技術。在果汁生產過程中，采用木聚糖酶、纖維素酶 和果膠酶共同處理能夠降低提取液的粘度，有利于過濾和濃縮。但在實際的生產W及應用 過程中，需要一些在中溫和低溫條件下穩定并且能夠較好地發揮酶活作用的木聚糖酶。因 此，獲得活性高且在中溫和低溫穩定的木聚糖酶對于木聚糖酶的工業應用具有重要的實踐 價值。

【發明內容】

[0004] 本發明目的在于提供一株粘滑白蟻球菌，該粘滑白蟻球菌的基因組中含有多個纖 維素酶基因和半纖維素酶基因。 陽〇化]本發明的第二個目的在于提供一種在低溫和中溫條件下酶活活性高且穩定的木 聚糖酶。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供一種編碼所述木聚糖酶的基因。
[0007] 本發明的又一個目的在于提供一種包含所述編碼木聚糖酶的基因的重組載體、轉 化子、重組病毒、重組菌和轉基因細胞系。
[0008] 本發明的再一個目的在于提供所述木聚糖酶在降解木聚糖方面的應用。
[0009] 為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為：
[0010] 一株粘滑白蟻球菌，該菌株命名為粘滑白蟻球菌TSB47燈ermitidicoccus mucosusTSB47)，已于2015年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中屯、，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC1. 12901。
[0011] 上述粘滑白蟻球菌TSB47的菌落形態及生理生化特性為：菌落呈白色、圓形、邊 緣整齊、濕潤、有光澤、不透明，菌細胞為大小約0. 5~0. 8μπι的球菌，有一個至多個痛 突，革蘭氏染色陰性，不產抱，無鞭毛或周毛，不具有運動性（圖1);該菌生長溫度范圍為 20°C-35°C，生長抑范圍為5. 5-9. 0,生長鹽度范圍為0%-2. 0%，能利用k阿拉伯糖、D-核 糖、D-木糖、D-半乳糖、果糖、D-甘露糖、山梨醇等為碳源生長，能同化精氨酸、尿素、屯葉 靈、對硝基-β-D-甲基半乳糖，具有堿性憐酸鹽酶、酸性憐酸酶、糞酪-AS-BI-憐酸水解酶 等酶的活性；該菌不能水解酪素，氧化酶、觸酶、醋酶、纖維素酶和淀粉水解酶均為陰性；細 胞壁氨基酸主要成分為：組氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和高絲氨酸等。
[0012] 上述粘滑白蟻球菌TSB47的基因序列特征為：粘滑白蟻球菌TSB47基因組大小 約為7. 29Mb，具有5520個編碼基因；該菌基因組中含有多個纖維素酶基因，包括3個內切 葡聚糖酶基因，14個葡萄糖巧酶基因；還含有多種多樣的半纖維素酶基因，其中木聚糖酶 基因有4個，β-木糖巧酶基因有3個，半乳糖巧酶基因有41個。采用BLAST分析法將 16SrRNA基因序列與GenBank數據庫進行比對分析，發現該菌株與化itutaceae科內細菌 OpitutaceaebacteriumTAV1的親緣關系最接近，但同源性也僅達98%，與Opitutaceae 科內其他已描述菌株的同源性均低于92. 5 %。但是迄今為止未見對化itutaceae bacteriumTAV1菌株的特征描述，而本發明所述菌株的生理生化等特征與除化itutaceae bacteriumTAVlW外的其它菌株有明顯差異，本發明中，將該菌命名為Termitidicoccus mucosusTSB47 (粘滑白蟻球菌TSB47)，該菌與化itutaceae科其它屬細菌的系統發育關系 詳見圖2。
[0013] 一種來自于粘滑白蟻球菌TSB47的木聚糖酶，命名為木聚糖酶TmXynl，其特征在 于，所述木聚糖酶TmXynl的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0014] 一種編碼上述木聚糖酶TmXynl的基因。所述編碼基因，為任何編碼上述木聚糖酶 TmXynl的DNA序列。
[0015] 上述方案中，所述編碼木聚糖酶TmXynl的基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所 /J、- 〇
[0016] 一種包含上述編碼木聚糖酶的基因的重組載體、轉化子、重組病毒、重組菌和轉基 因細胞系。 陽017] 上述木聚糖酶TmXynl在降解木聚糖方面的應用。
[0018] 本發明的有益效果如下：本發明篩選獲得了一株具有多種纖維素降解酶的粘滑白 蟻球菌TSB47,從粘滑白蟻球菌TSB47的基因中篩選獲得了木聚糖酶TmXynl的編碼基因，通 過構建重組質粒獲得重組菌、編碼基因表達后獲得了木聚糖酶TmXynl;本發明所述木聚糖 酶TmXynl在低溫和中溫條件下具有酶活活性高且穩定的優點，在木聚糖酶的工業應用具 有重要的實踐價值，在食品、飼料等行業中具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0019] 圖1為粘滑白蟻球菌TSB47的掃描電鏡圖片。
[0020] 圖2為粘滑白蟻球菌TSB47的系統發育分析圖
[0021] 圖3為木聚糖酶TmXynl最適反應溫度的測定結果。
[0022] 圖4為木聚糖酶TmXynl溫度穩定性的測定結果。
【具體實施方式】
[0023]為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的 內容不僅僅局限于下面的實施例。
[0024] 實施例1粘滑白蟻球菌TSB47的研究
[00巧]本實驗室從黑胸散白蟻腸道分離培養獲得了一株粘滑白蟻球菌，命名為粘滑白蟻 球菌TSB47。 陽0%]( -）、對粘滑白蟻球菌TSB47的形態學特征和生長特性作如下研究：
[0027] 粘滑白蟻球菌TSB47在1/3BHI培養基（配方：蛋白腺3. 3g/l，脫水小牛腦浸粉 4. 2g/l，脫水牛屯、浸粉1. 7g/l，氯化鋼1. 7g/l，葡萄糖0. 7g/l，憐酸氨二鋼0. 8g/l，抑值 7. 4)中30°C恒溫培養。將粘滑白蟻球菌TSB47接種到1/3BHI固體培養基培養五天，在平板 上形成白色、圓形、邊緣整齊、濕潤、有光澤、不透明的菌落，菌細胞為大小約0. 5~0. 8μπι 的球菌（掃描電鏡圖片見圖1)，有一個至多個痛突，革蘭氏染色陰性，不產抱，無鞭毛或周 毛，不具有運動性。將粘滑白蟻球菌TSB47W5%的接種量接種到1/3ΒΗΙ液體培養基培養， 測得該菌生長溫度范圍為20°C-35°C，最適生長溫度為25°C左右；生長抑范圍為5. 5-9. 0， 最適生長抑為7.5;在0% -2.0%鹽度范圍內可W生長，最適生長鹽度為0.5%。
[0028](二）、對粘滑白蟻球菌TSB47的生理生化特性作如下研究：
[0029] (1)碳源利用：應用API50CH試劑條研究粘滑白蟻球菌TSB47對碳源利用的特 性，結果表明，該菌可W利用k阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-果糖、D-甘露糖、 山梨醇、屯葉靈等底物代謝產酸。
[0030] 似細胞內酶活性與同化作用：應用APIZYM和API20肥試劑條研究粘滑白蟻球 菌TSB47的細胞內酶活性和同化作用，結果表明，該菌具有堿性憐酸鹽酶、酸性憐酸酶、糞 酪-AS-BI-憐酸水解酶等酶的活性；能夠同化精氨酸、尿素、屯葉靈、對硝基-β-D-甲基半 乳糖等，具有精氨酸雙水解酶、脈酶、β-葡萄糖巧酶、β-半乳糖巧酶等酶的活性。
[0031] (3)氧化酶、觸酶等其它酶活性粘滑白蟻球菌TSB47菌細胞作用等體積的 Iwt% (質量濃度）對-氨基二甲基苯胺鹽酸鹽水溶液和Ivt% (體積濃度）α-奈酪乙醇 溶液，根據顏色反應說明該菌氧化酶為陰性；W菌細胞作用5vt%&〇2未產生氣泡，說明其 觸酶為陰性；粘滑白蟻球菌TSB47能將硫代硫酸鋼還原為亞硫酸鹽并釋放出HzS;此外，該 菌不能水解酪素，醋酶、纖維素酶和淀粉水解酶均為陰性。
[0032] (4)細胞壁氨基酸組分分析：收集粘滑白蟻球菌TSB47菌細胞，制成全細胞水解 液，用薄層分析的方法進行測試，結果表明，該菌細胞壁氨基酸組分主要為：組氨酸化is)、 甘氨酸（Gly)、絲氨酸（Ser)、丙氨酸（Ala)、高絲氨酸化om)等。
[0033](Ξ)、對粘滑白蟻球菌TSB47基因組的研究
[0034]W1/3BHI液體培養基培養粘滑白蟻球菌TSB47,收集菌細胞，利用細菌基因組 DNA提取試劑盒提取粘滑白蟻球菌TSB-47的基因組DNA。使用化seq(大片段文庫）或 Miseq(小片段文庫）測序平臺對樣品進行測序。對測序結果進行分析，結果表明，粘滑白蟻 球菌TSB47基因組大小約為7. 29Mb，具有5520個編碼基因；該菌基因組中含有多個纖維素 酶基因，包括3個內切葡聚糖酶基因，14個葡萄糖巧酶基因；還含有多種多樣的半纖維素酶 基因，其中木聚糖酶基因有4個，β-木糖巧酶基因有3個，半乳糖巧酶基因有41個；此外， 該菌基因組還含有一些與氮代謝相關的基因。
[0035] 采用BLAST分析法將粘滑白蟻球菌TSB47的1