一株疣孢漆斑菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物農藥開發技術領域，具體涉及是一株疏孢漆斑菌Myrothecium verrucariaZW-2及其代謝產物在防治植物寄生線蟲中的用途。
【背景技術】
[0002] 由于植物寄生線蟲形體小，多數癥狀隱蔽，很難用肉眼直接觀察到，直至發生為 害嚴重才被重視。因此，給線蟲病害防治帶來極大的困難。長期以來，植物寄生線蟲病害 的防治主要依賴化學殺線劑，破壞生態平衡，污染環境，威脅人類的健康。在自然生態系統 中，植物根圍由植物寄生線蟲、自由生活線蟲，以及根圍生境中的其他微生物，包括真菌、 細菌和放線菌等，這些微生物之間相互制約保持生態平衡，使某種植物寄生線蟲群體不會 迅速上升對寄主造成危害，這種制約表現在土壤中某種微生物會通過附著等方式寄生在 植物寄生線蟲的卵、幼蟲或成蟲，導致線蟲死亡。例如，一些機會真菌會寄生在卵囊、雌蟲 或孢囊上，利用其內部的營養直接殺死線蟲，或通過產生有毒的代謝物間接毒殺卵或幼蟲 (Jatala, 1986)〇
[0003] 目前，已經有關于從土壤中分離獲得毒殺植物寄生線蟲的有潛力生防菌株研究報 道（馬金慧等，2014;焦俊等，2015)。這些對植物寄生線蟲具有高毒力的生防菌株，對新型 生物源農藥的研發具有十分重要的意義。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一株疏孢漆斑菌MyrotheciumverrucariaZW-2及其代謝 產物在防治植物寄生線蟲中的用途，該菌株具有良好的發酵優化和遺傳改造前景，同時也 具有重要的農業應用價值。
[0005] 本發明提供的技術方案為：
[0006] 本發明提供一株疏孢漆斑菌，其分類命名為MyrotheciumverrucariaZW-2,保藏 編號為CCTCCNO:M2015522。
[0007] 本發明還提供了所述的疏孢漆斑菌MyrotheciumverrucariaZW-2的代謝產物在 防治植物寄生線蟲中的應用。
[0008] 本發明的疣孢漆斑菌是從設施栽培蔬菜土壤中分離篩選出，研究發現該菌株對 南方根結線蟲具有很強毒殺活性真菌菌株，并對其進行深入研究，其基因序列如SEQID No. 1所示。結合菌株的形態特征、基因序列分析，將其鑒定為疏孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria)，因此，命名為MyrotheciumverrucariaZW_2，Genebank登錄號為KR708633。
[0009] 疏孢漆斑菌MyrotheciumverrucariaZW-2的分類地位是半知菌類，絲孢綱，瘤座 孢目，瘤座科，漆斑菌屬，疣孢漆斑菌。通過常規液體發酵培養制備，其代謝物對根結線蟲具 有毒殺線蟲的特性，對線蟲的毒殺致死效果顯著，室內測定本菌株發酵液對南方根結線蟲 二齡幼蟲、松材線蟲和大豆孢囊線蟲二齡幼蟲均有毒殺效果。不同稀釋濃度的發酵液處理 與無菌水處理有顯著差異，2周后發酵液的2倍、5倍、10倍、20倍和30倍稀釋液處理根結 線蟲J2,24h擊倒率可達100%，40倍稀釋液對J2的擊倒率達88%，盆栽試驗表明，菌株發 酵液2倍稀釋液處理根結線蟲二齡幼蟲72h，然后接種番茄，在接種30天后番茄根部根結的 數量與對照相比顯著減少。2倍和5倍稀釋液處理松材線蟲，72h死亡率分別為32. 96%和 30. 30 %，5倍稀釋液處理大豆孢囊線蟲二齡幼蟲48h死亡率30 %以上，因此，本發明的疣孢 漆斑菌MyrotheciumverrucariaZW-2具良好的農藥應用開發前景。
[0010] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0011] 本發明的疏孢漆斑菌MyrotheciumverrucariaZW-2經發酵后的代謝產物中含 有殺線蟲的有效成分，可用于植物寄生線蟲的生物防治，具有開發成為殺線蟲生物農藥的 潛力。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發明的疏孢漆斑菌MyrotheciumverrucariaZW-2菌株形態照片；
[0013] 其中：A培養物正面，B培養物背面。
[0014] 保藏信息說明
[0015]統抱漆斑菌MyrotheciumverrucariaZW-2,其保藏編號為CCTCCNO:M2015522， 保藏日期為2015年9月10日，保藏單位為中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢 武漢大學。
【具體實施方式】
[0016] 下列實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0017] 實施例1 :
[0018] 1. 1菌種活化擴大培養
[0019] 菌種疏孢漆斑菌MyrotheciumverrucariaZW-2為試管斜面保存，使用前需要將 試管內保存的菌種接種到（PDA)平板培養基中活化擴大培養。
[0020] 1. 2液體發酵培養
[0021] 然后將平板擴大將菌種接種到三角瓶液體培養基中，置于搖床，26°C±2°C， 150-180r/min培養 2 周。
[0022] 所述的液體發酵培養基配方為：NaN030. 15-0 . 25 %，KC1 0. 04-0. 06 %， FeS040 . 00 5-0 . 001 %，Κ2ΗΡ04(λ09-0. 15 %，MgS040 . 0 24-0 . 05 %，蔗糖 2-4 %，余量為水的體 積。250mL三角瓶，每瓶裝100mL液體培養基，121°C，0. 12-0. 17MPa，30min滅菌備用，以重 量百分比計。
[0023] 1. 3發酵液對南方根結線蟲（Meloidogyneincognita)二齡幼蟲、松材線蟲 (Bursaphelenchusxylophilus)、大豆抱囊線蟲（Heteroderaglycines)二齡幼蟲的毒殺 作用
[0024] 1. 3. 1發酵培養兩周，經0.45μπι濾膜過濾，65°C滅活菌種，濾液4°C保存兩周作為 供試發酵液；
[0025] 1. 3. 2利用貝曼漏斗法收集新鮮根結線蟲二齡幼蟲，配制線蟲懸浮液；
[0026] 1. 3. 3 96孔細胞培養板中每孔含300μL稀釋10倍的發酵液和50 ±5條二齡幼 蟲，空白發酵液10倍稀釋液和清水作為對照，置于25 °C恒溫箱中；
[0027] 1. 3. 4通過試驗觀察、計算發酵液處理后他、611、1211、2411、4811和7211對線蟲的擊倒 率和死亡率；
[0028] 1.3.4計算方法：線蟲死亡率（％) =(死亡的線蟲數量/供試線蟲總數 量）X100。72h內發酵液10倍稀釋液和清水對照均未有線蟲死亡，因此，線蟲的死亡率無 需要校正。
[0029] 1. 4研究結果
[0030] 1. 4. 1發酵液處理后線蟲的擊倒率和死亡率
[0031] 表1ZW-2菌株發酵液不同倍數稀釋液對根結線蟲J2的擊倒率（％ )
[0032]
[0034] 注：CK1為培養基對照（培養基2倍稀釋液）；CK2為無菌蒸餾水對照
[0035] 從表1可知，2倍、5倍、10倍、20倍和30倍發酵液的稀釋液在處理24h后對根結 線蟲J2擊倒率均達到100 %，并且在后續觀察時沒有出現恢復活動的現象，活性穩定；40倍 發酵液稀釋液在處理48h后擊倒率保持91. 3%。
[0036] 表2ZW-2菌株發酵液不同倍數稀釋液對根結線蟲J2的死亡率（％ )
[0037]
[0038] 注：CK1為培養基對照（培養基2倍稀釋液）；CK2為無菌蒸餾水對照
[0039] 從表2可知，2倍、5倍、10倍和20倍發酵液稀釋液處理48h后根結線蟲J2死亡 率均達到100% ;30倍和40倍稀釋液處理48h后死亡率達到99. 3%和95. 2%，但在處理 72h后死亡率均降低，為95. 5%和89. 3%，低濃度下毒殺活性降低，少量線蟲活性有恢復的 現象。
[0040] 綜上所述，本發明的疏孢漆斑菌MyrotheciumverrucariaZW-2在上述培養液發 酵的過程中能產生對根結線蟲二齡幼蟲有毒殺作用的活性成分，即該真菌產生的用于防 治植物寄生線蟲的真菌代謝物，可用于植物寄生線蟲的生物防治，具有開發成為殺線蟲生 物農藥的潛力。
[0041] 前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述 并非想將本發明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變 和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發明的特定原理及其實際應 用，從而使得本領域的技術人員能夠實現并利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及 各種不同的選擇和改變。本發明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。
[0042] SRQ)UF：KCRLISTING <iii>廣西大學 <】20> -株疣孢漆斑菌及其應用 <、130>ZYWS <160> 1 <170>F^tentinversion3.3 <210> 1 <211> 55V <2.1，頂A <213>Myrotheciumvermcaria<400> 1 cttccgtagggtgaacctgcggagggatcattaccgagtttacaaactcccaaacccttt60gtgaaccuaccatattgttgcttcggcgggaccgccccggcgccttcgggcccggaacc12:0 aggcgcccgccggaggccccaaactcttatgtctttagtggttttctcci：ctgagtgaca180 cataaacaaataaataaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaaga^4() acgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatclitg300
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【主權項】
1. 一株癀孢漆斑菌，其分類命名為Myrothecium verrucaria ZW-2,保藏編號為CCTCC NO :M 2015522。2. 根據權利要求1所述的癀孢漆斑菌Myrothecium verrucaria ZW-2的代謝產物在防 治植物寄生線蟲中的應用。
【專利摘要】本發明屬于微生物農藥開發技術領域，具體涉及是一株疣孢漆斑菌Myrothecium？verrucaria？ZW-2及其代謝產物在防治植物寄生線蟲中的用途。一株疣孢漆斑菌，其分類命名為Myrothecium？verrucaria？ZW-2，保藏編號為CCTCC？NO：M2015522。本發明的疣孢漆斑菌Myrothecium？verrucaria？ZW-2的代謝產物中含有殺線蟲的有效成分，可用于植物寄生線蟲的生物防治，具有開發成為殺線蟲生物農藥的潛力。CCTCC NO：M2010
【IPC分類】A01P5/00, C12R1/645, A01N63/04, C12N1/14
【公開號】CN105238701
【申請號】CN201510659357
【發明人】周勛波, 吳海燕, 莫愛素, 丘卓秋
【申請人】廣西大學
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月12日