一種新物種來源低分子肝素的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種新物種來源低分子肝素的制備方法，特別涉及一種利用牛來源 (牛肺、牛腸）和羊來源（羊腸）肝素制備低分子肝素的方法，屬于原料藥制備技術領域
【背景技術】
[0002] 肝素與低分子肝素同屬于抗凝血糖胺聚糖類臨床藥物，低分子肝素是由肝素經物 理方法、化學方法或者酶解法制備而成的新型抗血栓藥物。相對肝素而言，低分子肝素具有 更高的生物活性，更長的半衰期和更少的副作用，低分子肝素類藥物現已成為抗血栓抗凝 藥物的首選。肝素可從豬小腸、牛肺、牛腸、羊小腸等粘膜組織提取，肝素類臨床藥物歷史上 主要由豬和牛作為肝素的物種來源，但由于上世紀80年代末"瘋牛病"和"羊瘙癢病"的影 響，目前臨床藥用肝素類藥物避免使用牛和羊來源的肝素作為原料而只采用豬來源肝素。 豬來源肝素的市場壟斷已成為肝素類藥物市場不穩定的主要潛在因素，一旦豬來源肝素出 現安全問題，無其他可替代物種來源，則肝素類抗凝藥物市場將直接崩潰。且目前"瘋牛病" 發病機制已研究確認為主要由朊病毒傳染而導致，朊病毒已存在有效的滅活方法，并且"瘋 牛病"的流行可得到有效控制。各國政府也通過藥典明確規定肝素必須要進行無傳染性病 毒存在的認證，即利用現有的各種先進的純化技術已可保證牛和羊來源肝素的安全。
[0003] 全球每年屠宰大量的牛、羊，可會提供豐富的的牛、羊肝素資源。且隨著老齡化時 代的到來，對低分子肝素類藥物的需求量也將越來越大。因此將牛、羊作為低分子肝素類 藥物新的物種來源已是大勢所趨。美國RobertLinhardt教授實驗室已對豬、牛和羊來源 的肝素對比研究，三種肝素的分子量、硫酸化程度、乙酰化程度以及生物活性都存在顯著差 異。為進一步研究牛、羊肝素所制備的低分子肝素的藥用價值，首先需以牛、羊肝素為原料 制備牛、羊低分子肝素，然后與市售低分子肝素標準品進行結構和活性差異的比較。

【發明內容】

[0004] 本發明針對現有低分子肝素類藥物來源物種單一、制得的低分子肝素分子量仍然 較大的問題，提供一種新物種來源低分子肝素的制備方法。
[0005] 發明概述
[0006] 本發明利用從牛、羊體內提取的肝素按照相關方法制備依諾肝素鈉，并通過分別 與USP標準品進行結構與抗凝活性的比較，從而確定以上低分子肝素類藥物的臨床應用價 值。
[0007] 發明詳述
[0008] 本發明技術方案如下：
[0009] -種新物種來源低分子肝素的制備方法，步驟如下：
[0010] (1)將由原料牛肺、牛腸和/或羊腸制備的肝素鈉完全溶解于水中，加入芐索氯銨 溶液，芐索氯銨與肝素鈉的質量比為2~4倍，固液分離，干燥，制得肝素芐索氯銨鹽；
[0011] (2)將步驟（1)制得的肝素芐索氯銨鹽溶解于二氯甲烷中，加入氯化芐，肝素芐索 氯銨鹽與氯化芐的質量體積比為1~2,單位為g/mL，25~40°C攪拌反應12~20小時，降 溫并加入等體積的質量濃度為8~10%的醋酸鈉甲醇溶液，固液分離，干燥，制得肝素芐基 醋；
[0012] (3)將步驟（2)制得的肝素芐基酯溶于水中，在55~65°C條件下，加入氫氧化鈉， 使氫氧化鈉濃度為〇. 05~0. 1M，反應20~90分鐘，降溫至18~22°C，調pH至中性，加入 氯化鈉使氯化鈉質量濃度為8~10%，在加入反應液3~5倍體積的醇，固液分離，干燥，制 得依諾肝素鈉粗品；
[0013] (4)將步驟⑶制得的依諾肝素鈉粗品溶于水中，經純化，干燥，制得依諾肝素鈉。
[0014] 根據本發明優選的，所述步驟（1)中，肝素鈉與水的質量體積比為0. 1~0. 3,單 位：g/mL〇
[0015] 根據本發明優選的，所述步驟（1)~（3)中，固液分離為過濾或離心。
[0016] 根據本發明優選的，所述步驟（2)中，肝素芐索氯銨鹽與二氯甲烷的質量體積比 為1 : (2~5)，單位g/mL。
[0017] 根據本發明優選的，所述步驟（3)中，肝素芐基酯與水的質量體積比為1 :(20~ 25)，單位g/mL。
[0018] 根據本發明優選的，所述步驟（3)中，醇為甲醇或乙醇。
[0019] 根據本發明優選的，所述步驟（4)中，純化為超濾、醇沉或透析；優選的，透析膜分 子量為lkD。
[0020] 根據本發明優選的，所述步驟（4)中，干燥為-50~-60°C凍干。
[0021] 有益效果
[0022] 本發明首次發現通過處理牛肺、牛腸和羊腸原料制備的肝素鈉可以獲得低分子肝 素，不僅解決了藥物產業鏈原料來源單一的問題，而且由于制得的低分子肝素較現有低分 子肝素分子量更低，因此其生物活性更高，具有廣闊的市場應用前景。
【附圖說明】
[0023] 圖1、依諾肝素鈉高效液相凝膠滲透色譜圖；
[0024] 圖中：USP依諾標準品為分子量標準；
[0025] 豬腸依諾樣品為對比例1制得的符合USP依諾標準品分子量標準的樣品；
[0026] 牛肺依諾樣品-1為對比例2制得的不符合USP依諾標準品分子量標準的樣品；
[0027] 牛肺依諾樣品-2為實施例1制得的符合USP依諾標準品分子量標準的樣品；
[0028] 圖2、樣品牛肺依諾樣品-2 (圖上）與USP依諾標準品（圖下）核磁Η譜比較；
【具體實施方式】
[0029] 下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于 此。
[0030] 實施例和對比例中所述的原料牛肺制備的肝素鈉實驗室純化得到
[0031] 對比例中所述的原料豬腸制備的肝素鈉購自常山生化藥業有限公司 [0032] 實施例1
[0033] -種新物種來源低分子肝素的制備方法，步驟如下：
[0034] (1)將由原料牛肺制備的肝素鈉lg完全溶解于lOmL水中，緩慢滴加20%的芐索 氯銨溶液10mL，過濾，烘干，制得肝素芐索氯銨鹽；
[0035] (2)將步驟（1)制得的肝素芐索氯銨鹽2. 5g溶解于6mL二氯甲烷中，滴加2. 5mL 氯化芐，35°C攪拌反應15小時，降溫并加入等體積的質量濃度為8%的醋酸鈉甲醇溶液，過 濾，烘干，制得肝素芐基酯；
[0036] (3)將步驟（2)制得的lg肝素芐基酯溶于25mL水中，在60°C條件下，加入氫氧化 鈉，使氫氧化鈉濃度為〇. 07M，反應30分鐘，降溫至20°C，調pH至中性，加入氯化鈉使氯化 鈉質量濃度為10%，加入75mL的甲醇，過濾，干燥，制得依諾肝素鈉粗品；
[0037] (4)將步驟⑶制得的依諾肝素鈉粗品溶于水中，透析48小時后，經_60°C凍干， 制得牛肺依諾肝素鈉，記為牛肺依諾樣品-2。
[0038] 實施例2
[0039] -種新物種來源低分子肝素的制備方法，步驟如下：
[0040] (1)將由原料牛腸制備的肝素鈉lg完全溶解于20mL水中，緩慢滴加20%的芐索 氯銨溶液15mL，過濾，烘干，制得肝素芐索氯銨鹽；
[0041] (2)將步驟⑴制得的肝素芐索氯銨鹽2. 5g溶解于10mL二氯甲烷中，滴加4mL氯 化芐，40°C攪拌反應12小時，降溫并加入等體積的質量濃度為10%的醋酸鈉甲醇溶液，過 濾，烘干，制得肝素芐基酯；
[0042] (3)將步驟（2)制得的lg肝素芐基酯溶于25mL水中，在55°C條件下，加入氫氧化 鈉，使氫氧化鈉濃度為〇. 1M，反應30分鐘，降溫至20°C，調pH至中性，加入氯化鈉使氯化鈉 質量濃度