用于木糖發酵制氫的菌株及制氫方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于木糖發酵制氨技術領域，涉及用于木糖發酵制氨的菌株及其制氨方 法。
【背景技術】
[0002] &作為一種環境友好的可再生的清潔新能源已經引起人們的廣泛關注和深入研 究。氨氣的制備方法中，生物制氨技術W可再生的生物質原料來制取清潔能源氨氣，是最有 前景的制氨技術。相對于光解水制氨和光合細菌制氨，暗發酵制氨不需要提供光源，反應器 簡單，底物利用范圍廣泛，可W利用能源作物或者是農業廢棄物作為發酵底物。
[0003] 暗發酵制氨是利用產氨微生物轉化生物質的生物制氨技術，目前已知的暗發 酵產氨細菌主要有；腸桿菌巧nterobacter sp.)、芽抱桿菌度acillus sp.)和梭菌 (ClostridiumSP.)。但是大多數的研究都集中在梭菌和腸桿菌。目前發酵產氨的底物來 源主要有葡萄糖和淀粉等糧食作物，為了避免發生與人爭糧的現象，同時踐行變廢為寶的 理念，工業廢水、農業廢棄物或市政餐廚垃圾等高有機質含量的廢棄物成為了發酵產氨的 底物，送些底物在單一菌種或者混合微生物菌群的作用下被降解。但是地球上含量最豐富 的纖維素類物質由于其中含有的木質素的難生物降解性而成為纖維素類物質開發使用的 瓶頸。
[0004] 木質纖維素中含有35% -45%的纖維素、25% -40%的半纖維素（己糖和木糖的雜 聚物）和20% -35%的木質素。木質纖維素經水解后的產物主要有葡萄糖和木糖，前者是 微生物菌種廣泛應用的底物，但是能夠利用木糖的微生物種類少之又少。
[0005] 基于上述分析，本發明的發明人認為目前存在的問題是需要篩選出能夠使木糖降 解產氨的菌株，尤其是能夠使木糖降解并大量產氨的菌株W及利用所篩選的菌株進行木糖 發酵制氨的方法，W使得纖維素類物質能夠完全被利用的同時得到大量的氨。

【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供了用于木糖發酵制 氨的菌株，所述菌株為蠟樣芽抱桿菌Sl株和圓滑短波單胞菌Zl株，送些菌株是基于木糖 降解篩選獲得，具有較高的產氨能力。
[0007] 本發明還提供了一種木糖發酵制氨方法，該方法W木糖為底物，采用蠟樣芽抱桿 菌Sl株和/或圓滑短波單胞菌Zl株進行發酵培養制氨，工藝簡單，產氨效率高，尤其是采 用菌株混合物進行發酵制氨時菌間具有很好的協同作用，產氨效率更高，可W用于工業化 生產。
[0008] 為此，本發明第一方面提供了一種用于木糖發酵制氨的菌株，其中，所述菌株為蠟 樣芽抱桿菌Sl株度acillus cereus, Strain SI),其保藏編號為；CGMCC NO. 9035,保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中必（簡稱；CGMCC ;地址；北京市朝陽區北辰 西路1號院3號中國科學院微生物研究所），保藏日期：2014年4月11日。
[0009] 本發明第二方面提供了一種用于木糖發酵制氨的菌株，其中，所述菌株為圓滑 短波單胞菌Zl株度revundimonasnaejangsanensis,StrainZl),其保藏編號為；CGMCC NO. 9036,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中必（簡稱；CGMCC;地址；北 京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所），保藏日期：2014年4月11日。
[0010] 本發明第H個方面提供了一種木糖發酵制氨方法，包括將發酵菌種接種至發酵培 養基中進行發酵培養的步驟，其中，所述發酵菌種由相應的菌株經過種子培養獲得。發酵菌 種包括菌種M和/或菌種N。
[0011] 制備菌種M相應的菌株M為與本發明第一方面所述的蠟樣芽抱桿菌Sl株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株；優選所述發酵菌株M為與本發明第一方面所述的蠟樣芽 抱桿菌Sl株的16SrRNA的同源性至少為95%的菌株；進一步優選所述發酵菌株M為如本 發明第一方面所述的蠟樣芽抱桿菌Sl株。所述蠟樣芽抱桿菌Sl株的16SrRNA序列如序 列表中的SEQNO. 1所示。
[0012] 制備菌種N相應的菌株N為與本發明第二方面所述的圓滑短波單胞菌Zl株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株；優選所述發酵菌株N為與本發明第二方面所述的圓滑短 波單胞菌Zl株的16SrRNA的同源性至少為95%的菌株；進一步優選所述發酵菌株N為如 本發明第二方面所述的圓滑短波單胞菌Zl株。所述圓滑短波單胞菌Zl株的16SrRNA序 列如序列表中的SEQNO. 2所示。
[0013] 正如本領域技術人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變 異，然而，當變異不影響其蛋白質合成、結構或者主要作用功能區時，該微生物之他種野外 分離株即使基因序列無法百分之百相同，其基本的生理功能并不會有所改變。但是同源性 比較如果針對全部的基因來進行比對，實際上是非常巨大的工程，不太可行，目前國際上常 使用16S化bosomalRNA(16SrRNA)來進行細菌型的分辨，因此在相似性的比較上可W用 16SrRNA來進行比對而得到其同源性。所W本發明所使用的發酵菌株并不限定于本發明所 使用的野外分離株，16srRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所 有細菌的染色體基因組中。16SrRNA具有高度的保守性和特異性W及該基因序列足夠長 (包含約50個功能域）。
[0014] 因此，本發明中，菌株M為與本發明第一方面所述的蠟樣芽抱桿菌Sl株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株。優選菌株M為與第一方面所述的蠟樣芽抱桿菌Sl株的 16SrRNA的同源性至少為95%的菌株。進一步優選的是，菌株M為如本發明第一方面所述 的蠟樣芽抱桿菌Sl株。即在不改變蠟樣芽抱桿菌Sl株的16SrRNA的前提下，本領域技術 人員可W通過簡單的篩選或誘變本發明的蠟樣芽抱桿菌Sl株，獲得與本發明蠟樣芽抱桿 菌Sl株16SrRNA高度同源的菌株，并獲得相應地具有相同或相似的木糖發酵產氨功能的 菌株種子液的混合物。
[0015] 類似地，本發明中，菌株N為與本發明第二方面所述的圓滑短波單胞菌Zl株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株。優選菌株N為與第二方面所述的圓滑短波單胞菌Zl株 的16SrRNA的同源性至少為95%的菌株。進一步優選的是，菌株N為如本發明第二方面所 述的圓滑短波單胞菌Zl株。即在不改變圓滑短波單胞菌Zl株的16SrRNA的前提下，本領 域技術人員可W通過簡單的篩選或誘變本發明的圓滑短波單胞菌Zl株，獲得與本發明圓 滑短波單胞菌Zl株16SrRNA高度同源的菌株，并獲得相應地具有相同或相似的木糖發酵 產氨功能的菌株種子液的混合物。
[0016] 在本發明的一個實施例中，所述發酵培養步驟中，還包括收集發酵過程中所產生 的氣體的操作。
[0017] 根據本發明，所述發酵培養為兼氧或厭氧發酵培養。優選所述發酵培養為厭氧發 酵培養。木糖發酵產氨必須是兼氧或厭氧發酵，如果采用有氧發酵就無法很好的實現產氨。
[0018] 根據本發明方法，所述發酵培養為菌種游離發酵培養，發酵菌種W種子液的形式 接種到發酵培養基。所述種子液的接種的量W體積計為2% -30%。優選所述種子液的接 種的量W體積計為10% -20%。
[0019]所述種子培養是將菌株接種至種子培養基，培養后獲得含有菌種的種子液。在含 有菌種M的種子液中，菌種M的含量為0. 001-0.Ig/mL。在含有菌種N的種子液中，菌種N 的含量為 0. 001-0.Ig/mL。
[0020] 在本發明的一些實施例中，當發酵菌種為菌種M和菌種N時，在所接種的種子液 中，含有菌種M的種子液與含有菌種N的種子液的體積比為10 : 0.01-0.01 : 10。優選 含有菌種M的種子液與含有菌種N的種子液的體積比為0.1 : 1-10 : 1。
[0021] 根據本發明方法，所述發酵培養為菌種固定化發酵培養，發酵菌種W負載于載體 的形式接種到發酵培養基。
[0022] 根據本發明方法，所述載體包括吸附載體和包埋載體，所述吸附載體選自大孔樹 月旨、娃藻±、多孔玻璃、活性炭、木屑、陶瓷、沸石、絲瓜絡、枯桿、玉米芯和人工纖維材料中至 少一種；所述包埋載體選自海藻酸鋼、瓊脂、卡拉膠、聚丙帰醜胺凝膠和聚己帰醇凝膠中至 少一種。
[0023] 在本發明的一些實施例中，所述菌種在載體上的負載量為0. 010-0. 05g/g。
[0024] 在本發明的一些實施例中，負載有菌種的載體的接種量為2-lOg/L。
[0025]在本發明的一些實施例中，菌種負載于載體的操作，包括將菌株接種到分散有載 體的種子培養基中，在l〇-6(TC下，攬拌轉速在10-300巧m之間，培養24-10她，制得載有菌 種的載體，其中所述菌株包