一種金屬螯合納米介質及制備方法和應用于強化包涵體蛋白復性與集成純化的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域中的蛋白質復性和分離技術；涉及一種金屬螯合納米介 質及制備方法和應用于強化包涵體蛋白復性與集成純化的方法。
【背景技術】
[0002] 基因工程技術的飛速發展，使得基因工程藥物的大規模生產成為可能。此類藥物 的生產需要適宜的重組基因表達系統，細菌表達系統表達目標蛋白具有快速、大量、廉價的 優點，但是外源蛋白的過量表達經常形成蛋白的聚集體，即包涵體。包涵體不具有生物學活 性，需要重新折疊復性才能恢復其天然結構和生物活性。復性過程中折疊中間體之間疏水 作用導致的聚集是降低復性收率的重要原因，因此，抑制聚集是促進復性的關鍵。與此同 時，復性之后的包涵體蛋白很難得到高效的分離純化，這也是限制其大規模生產的重要環
[0003] 復性體系中加入抑制蛋白質聚集的小分子添加劑，如低濃度的變性劑，精氨酸，人 工分子伴侶，甘油等，能夠有效促進蛋白質復性。但是添加劑的使用會在復性體系中引入新 的雜質，不利于后期目標蛋白的分離純化；并且許多復性添加劑在抑制分子間聚集的同時， 也會抑制蛋白質的分子內折疊，造成復性速率降低。色譜復性的方法不僅可以有效抑制蛋 白質的聚集，在復性的同時還對蛋白質有一定的分離純化效果。但是介質與蛋白質分子間 的吸附作用會導致色譜復性達到平衡的時間延長，速率降低；并且回收產品的濃度較低。
[0004] 為了克服小分子添加劑輔助復性和色譜復性技術的不足，有申請人提出同電荷 的荷電物質抑制蛋白質聚集、促進蛋白質復性的方法（離子交換色譜介質輔助蛋白質復 性的方法及應用，CN101948504A，2011)。與傳統復性方法相比，同電荷介質促進蛋白質 復性的方法既不會對目標蛋白質造成污染，也不會降低蛋白質的折疊速率，并且操作簡 單、介質易于回收，無需昂貴的大型設備。目前復性研究中用到的同電荷介質主要包括多 孔的瓊脂糖凝膠介質、無孔的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球介質以及納米粒子等。其中 無孔微球介質由于比表面積有限，電荷修飾密度較低（300ymol/g)，限制了其輔助復性 的效果，需要通過二次修飾的方法來進一步提高電荷密度（配基修飾提高微球介質電荷 密度促進蛋白質復性的方法，CN103601791A，2014)。而多孔的瓊脂糖凝膠介質雖然可以 達到很高的電荷密度（1200ymol/g)，但是介質與同電荷蛋白質分子間的靜電排斥作用 導致蛋白質分子無法進入孔道內，因而只有介質的外表面才能發揮作用（Ion-exehange resinsfacilitatelike-chargedproteinrefolding:Effectsofporoussolidphase properties.JournalofChromatographyA，2012, 1225, 168-173)D 而納米粒子由于比表 面積大，可修飾電荷密度高，在輔助同電荷蛋白質復性中具有較大優勢（EnhancedProtein AdsorptionandFacilitatedRefoldingofLike-ChargedProteinwithHighly ChargedSilicaNanoparticlesFabricatedbySequentialDoubleModifications. Langmuir，2015, 31，655 - 658)。近來申請人基于同電荷介質輔助復性的方法，建立了一 種亞氨基二乙酸（IDA)修飾的瓊脂糖凝膠介質IDA-S印haroseFF輔助同電荷的綠色熒 光蛋白包涵體的復性與集成純化的方法（Integrativerefoldingandpurificationof histidine-taggedproteinbylike-chargefacilitatedrefoldingandmetal-chelate affinityadsorption.JournalofChromatographyA, 1344, 59 - 65) 〇 該方法集成了同電 荷介質輔助復性和金屬螯合純化技術，同時實現了目標蛋白質的復性和分離純化。但是受 到介質表面IDA修飾方法的限制，介質表面的電荷密度較低（約為108ymol/g)，因此對于 較高濃度的包涵體輔助復性的效果并不理想。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于克服現有技術的不足，本發明提出了在平均粒徑為20-30nm的 二氧化娃納米粒子（SNPs)表面接枝聚合物制備高電荷密度的金屬螯合納米介質來強化 包涵體蛋白的復性與集成純化的方法，該方法得到的金屬螯合納米介質的電荷密度達到 2520-5680ymol/g，遠高于當前同電荷蛋白質復性研究中用到的其他介質的電荷密度。并 且與金屬螯合微球介質IDA-SepharoseFF相比，該方法具有介質用量少、復性收率高、適用 于更高濃度包涵體蛋白復性的特點，同時對于目標蛋白具有較好的純化和富集效果，并且 操作簡便易行，成本低廉，大大簡化了復性純化工藝，更適合應用于大規模工業化生產。
[0006] 本發明的技術方案概述如下：
[0007] 本發明將亞氨基二乙酸（IDA)與甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA)的連接產物 GMA-IDA作為單體，利用原子轉移自由基聚合（ATRP)方法，在平均粒徑為20-30nm的二氧化 娃納米粒子表面引發接枝聚合，得到電荷密度為2520-5680ymol/g的金屬螯合納米介質 SNPs-P(GMA-IDA)〇
[0008] 上述GMA-IDA的結構式如下：
[0009]
[0010] 上述金屬螯合納米介質SNPs-P(GMA-IDA)的結構表達如下：
[0011]
[0012] 在平均粒徑為20-30nm的二氧化硅納米粒子（SNPs)表面接枝亞氨基二乙酸（IDA) 與甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA)的連接聚合物P(GMA-IDA);金屬螯合納米介質的電荷密度 為 2520-5680ymol/g〇
[0013] 其中n值的范圍需滿足金屬螯合納米介質的電荷密度達到2520-5680ymol/g。
[0014] 本發明的金屬螯合納米介質的制備方法，其步驟如下：
[0015] 1)合成GMA與IDA的連接產物GMA-IDA;
[0016] 2)在平均粒徑為20-30nm的二氧化硅納米粒子表面固定引發劑2-溴代異丁酰溴 (BIBB)，得到固定BIBB的二氧化硅納米粒子SNPs-Br;
[0017] 3)將上述步驟2)中的固定BIBB的二氧化硅納米粒子SNPs-Br加入到N，N-二甲 基甲酰胺（DMF)與水的混合液體中，配成濃度為0. 1-0. 2g/mL的懸浮液，DMF與水的體積比 為 1:2 ;
[0018] 4)上述步驟3)的懸浮液中加入GMA-IDA單體、CuBr催化劑、2義-聯吡啶（Bpy) 配體和CuBr^性劑，GMA-IDA的濃度為0? 2-1.Omol/L，溶液以N，N-二甲基甲酰胺（DMF)與 水的混合液體計算，各組分的摩爾濃度比為GMA-IDA:CuBr:CuBr2:Bpy= 100:1:0. 2:2,聚 合反應l-2h，制備得到金屬螯合納米介質SNPs-P(GMA-IDA)。
[0019] 所述步驟1)方法中，GMA-IDA的合成方法見文獻（SynthesisofMagnetic ChelatorforHigh-CapacityImmobilizedMetalAffinityAdsorptionofProteinby CeriumInitiatedGraftPolymerization,Langmuir, 2005, 21，6987-6994)〇
[0020] 所述步驟2)方法中，引發劑BIBB的固定按照通用方法進行，具體步驟見文 獻(SynthesisofDualThermosensitiveandpH-SensitiveHollowNanospheres BasedonPoly(acrylicacid-b-2-hydroxyethy1methacrylate)viaanAtomTransfer ReversibleAddition-FragmentationRadicalProcess,2012, 68, 159-166)〇
[0021] 本發明得到的金屬螯合納米介質的電荷密度為2520-5680ymol/g，極高的電荷密 度增強了介質與同電荷蛋白質分子間的靜電排斥作用，從而更有效地抑制蛋白質的聚集； 納米介質極高的比表面積使得同電荷的蛋白質分子在空間上得到更有效的定向排布，因此 更有利于同電荷蛋白質的復性；此外，納米介質表面大量的金屬螯合基團，保證了聚組氨酸 標記的重組目標蛋白在復性完成之后能夠得到有效的吸附和分離。
[0022] 本發明的高電荷密度的金屬螯合納米介質用于強化包涵體蛋白復性與集成純化 的方法，其步驟如下：
[0023] 1)將金屬螯合納米介質加入到同電荷包涵體蛋白質的復性緩沖液中，然后加入變 性溶解的包涵體蛋白進行復性；
[0024] 2)復性完成后，體系中加入鎳離子，對目標蛋白進行特異性吸附；
[0025] 3)吸附完成后，離心移除上清液，用洗滌緩沖液沖洗納米介質；
[0026] 4)將納米介質加入到洗脫緩沖液中進行目標蛋白的洗脫，洗脫完成后，離心收集 洗脫液，獲得純化的目標蛋白。
[0027] 所述的復性緩沖液為：20-100mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris)及0-2. 0mol/L尿 素的混合溶液；用HC1調pH至7. 5-9. 0 ;
[0028] 洗滌緩沖液為：50-100mmol/LTris, 10-50mmol/L咪唑，0? 1-0