優化的靶向md-2的高效抗炎多肽的制作方法【
技術領域：
】[0001]本發明屬生物醫藥領域，特別涉及經優化的靶向MD-2的高效抗炎多肽，以及所述多肽在制備用于治療因感染造成相關的過度炎癥性損害類疾病，如膿毒癥的藥物中的應用。【
背景技術：
】[0002]細菌感染，特別是革蘭氏陰性菌感染所導致的膿毒癥已成為當前臨床病人，特別是外科ICU患者死亡的主要原因。細菌對機體造成的感染膿毒癥通常由細菌外毒素及內毒素對機體的刺激產生。細菌毒素進入體內后，首先刺激免疫炎癥細胞，通過機體模式識別受體，主要為TLR2和TLR4受體，啟動機體的感染免疫反應，但當機體遭受過度刺激后，大量產生的炎癥介質則可對機體造成一系列過度的炎癥性損害。有鑒于此，采用恰當的免疫策略對膿毒癥實施有效防治，已成為當前免疫學家、臨床學家以及制藥行業關注的重點問題之〇[0003]對各種疾病的治療都應集中在發病早期環節上，免疫細胞對細菌內毒素脂多糖(lipopolysacchride，LPS)的識別是炎癥反應發生的初始環節，如何調控免疫炎癥細胞對LPS的識別，下調LPS所致的過度炎癥反應，從而在減輕炎癥性損害的同時，又不影響機體免疫細胞正常的抗感染免疫功能則應是針對膿毒癥實施有效免疫治療的理想策略。[0004]在免疫炎癥細胞LPS的膜式識別受體復合物（TLR4/MD2/CD14)中，任何一個功能結構域的破壞都導致LPS信號轉導障礙。資料證實，CD14與TLR4/MD2的親和力較弱，而TLR4/MD2的親和力較強，并且MD2(myeloiddifferentialprotein2,髓樣分化蛋白2)同TLR4(tolllikereceptor4，Toll樣受體4)的結合發生在同LPS結合之前，喪失LPS結合功能的MD2即使結合在TLR4胞外區，也不能賦予TLR4對LPS的反應性。表明MD2分子中與LPS結合的結構域對整個復合體的功能乃至之后的信號轉導強度都有決定性的作用。并且，MD2與TLR4的胞外區相耦聯，是一個只含有160個氨基酸的分泌蛋白，具有分子量小，核酸片段短，且為可分泌型等特點，對MD2的調控更易于操作，因而成為治療內毒素休克十分有潛力的祀點之一。[0005]由于MD2在結合LPS及誘導其信號的胞內傳導中都起著關鍵的作用。阻斷LPS與MD2的結合，比阻斷LPS與TLR4/MD2的結合要容易近100倍。因而發明人在申請號為CN200710092404.8的中國專利申請中已經成功篩選出2條針對MD-2的拮抗多肽：T6和Tl1，可部分阻斷MD-2與LPS的結合。[0006]發明人通過上述前期研究，發現T6和Tll對MD-2與LPS結合的阻斷的效率不高。為了獲得具有更高抗炎活性的多肽，經過進一步研究證實，根據靶標蛋白在噬菌體展示肽庫中篩選出陽性序列，再根據陽性序列構建突變肽庫，進一步篩選靶標蛋白，篩選后得到的陽性克隆效果更佳。本研究旨在通過對原始多肽（MD-2拮抗多肽）進行突變多肽庫的構建、篩選和功能鑒定，最終獲得具有更高抗炎活性的多肽。[0007]目前在我國尚無準確的膿毒癥發病率數據，但參考美國近期統計數據，每年膿毒癥發生病例約為75萬例，我國人口為美國人口4-5倍，加之我國目前的醫療條件與歐美發達國家相比尚有較大差距，推測我國每年發生膿毒癥的病例約1千萬例。因此，市場前景十分廣闊。經推斷，2014年度我國在抗感染方面實際費用大約為：4800億元人民幣。因此，有關膿毒癥藥物一旦全面推向市場，其經濟效益不可估量。[0008]目前國內外醫療市場尚無直接針對膿毒癥的發生、發展而研制的新型生物制劑，一旦完成基礎和臨床實驗，獲準進入臨床應用，必將具有非常明顯的社會效益和經濟效益。【
發明內容】[0009]本發明的目的是提供一種優化的靶向MD-2的抗炎多肽，所述多肽包括如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；優選地，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。然而，本領域技術人員理解，可在SEQIDN0:6中天然產生或人工引入突變或變異（包括但不限于，置換，缺失和/或添加），所產生的變體保留其生物學特性。[0010]根據本發明，當在蛋白/多肽的背景中使用時，術語"變體"是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與參照蛋白/多肽（例如，本發明的優化的靶向MD-2的抗炎多肽）的氨基酸序列具有一個或多個（例如1-9個或1-5個或1-3個）氨基酸差異（例如，保守氨基酸置換），或者具有至少80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了參照蛋白/多肽的必要特性。在本發明中，蛋白/多肽的必要特性可以指，靶向MD-2的抗炎特性。[0011]根據本發明，術語"同一性"用于指兩個多肽之間或兩個核酸之間序列的匹配情況。當兩個進行比較的序列中的某個位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據時（例如，兩個DNA分子的每一個中的某個位置都被腺嘌呤占據，或兩個多肽的每一個中的某個位置都被賴氨酸占據），那么各分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的"百分數同一性"是由這兩個序列共有的匹配位置數目除以進行比較的位置數目XlOO的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性（總共6個位置中有3個位置匹配）。通常，在將兩個序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，可通過計算機程序例如Align程序（DNAstar,Inc.)方便地進行的Needleman等人（1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法來實現。還可使用已整合入ALIGN程序（版本2.0)的E.Meyers和W.MiIler(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120權重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一1性。此外，可使用已整合入GCG軟件包（可在www.gcg.com上獲得）的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權重（gapweight)和1、2、3、4、5或6的長度權重來測定兩個氨基酸序列之間的百分數同一性。[0012]如本文中使用的，術語"保守置換"意指不會不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物學活性的氨基酸置換。例如，可通過本領域內已知的標準技術例如定點誘變和PCR介導的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學上或功能上與相應的氨基酸殘基相似（例如具有相似大小、形狀、電荷、化學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等）的殘基進行的置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈（例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸）、酸性側鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電荷的極性側鏈（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非極性側鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β分支側鏈（例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和芳香族側鏈（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。因此，優選用來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基替代相應的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領域內是熟知的（參見，例如，Bru_ell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412-417(1997)，其通過引用并入本文）。[0013]根據本發明，優化的靶向MD-2的抗炎多肽與其他蛋白的連接可包括例如融合和綴合等。特別地，優化的靶向MD-2的抗炎多肽可通過接頭與其他蛋白連接。根據本發明，術語"接頭"是指用于連接兩個分子（例如蛋白）的短肽。通常，通過將編碼該短肽的多核苷酸序列引入（例如，通過PCR擴增或連接酶）分別編碼所要連接的兩種目的蛋白的2個DNA片段之間，并進行蛋白質表達來獲得融合蛋白，例如目的蛋白1-接頭-目的蛋白2。如本領域技術人員公知的，接頭包括但不限于柔性連接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3O[0014]在本發明中，氨基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。[0015]在本發明中，術語"多肽"和"蛋白質"具有相同的含義，可互換使用。[0016]在另一個方面，本發明涉及編碼優化的靶向MD-2的抗炎多肽、其變體或其融合蛋白的多核苷酸及含有該多核苷酸的載體。優選地，所述多核苷酸包含如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；優選地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。[0017]可用于插入目的多核苷酸的載體是本領域公知的，包括但不限于克隆載體和表達載體。在一個實施方案中，載體是例如質粒，粘粒，噬菌體，柯斯質粒等等。[0018]在另一個方面，本發明還涉及包含上述多核苷酸或載體的宿主細胞。此類宿主細胞包括但不限于，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲細胞，植物細胞和動物細胞（如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等當前第1頁1 2 3