使用受體Na/K-ATPase/Src復合物進行的測定法和基于細胞的測試及其用圖
【專利說明】使用受體Na/K-ATPase/Src復合物進行的測定法和基于細 胞的測試及其用途
[0001] 發明人：謝子建，Joseph I. Shapiro,賴芳芳
[0002] 相關申請的交叉引用
[0003] 本申請要求美國臨時申請序列號61/664, 232 (提交于2012年5月8日）的權益， 其全部公開明確地通過引用并入本文。
[0004] 關于聯邦資助研宄的聲明
[0005] 本發明在美國政府支持下進行，基金編號為HL-109015,由美國國立衛生研宄院基 金編號頒布。美國政府擁有本發明的特定權利。
[0006] 本發明技術領域及工業應用
[0007] 本發明涉及操作方法，其篩選受體Na/K-ATPase/Src的激動劑和拮抗劑，并涉及 鑒定不飽和脂肪酸、二硫化谷胱甘肽（GSSG)和有機硫化合物衍生物鑒定為部分激動劑，鑒 定MB-5、姜黃素、姜黃素衍生物、丹參素、丹參酮、丹參酮衍生物、黃芪甲苷IV和阿魏酸為受 體拮抗劑。
[0008] 發明背景
[0009] 癌癥是全球死亡發生的主要致因。根據世界衛生組織（WHO)統計，2008年癌癥在 世界范圍引起的死亡為760萬例，占總死亡的約13%，預期這一數字到2030年為止會增加 到1200萬例。充血性心臟衰竭（Congestive Heart Failure，CHF)的發生率也呈上升趨 勢，在美國有500萬人受其影響。1000名70歲以上人群中有大約8人被診斷為患有CHF。
[0010] 因為受體Na/K-ATPase/Src復合物的激動劑造成的生理刺激對正常的腎、心和肺 功能的維持十分重要，且其能保護器官，所以對受體Na/K-ATPase/Src復合物的激動劑的 開發是有益的。因為持續的刺激會導致異常生長（腫瘤）和器官纖維化，所以拮抗劑的開 發可用于癌癥和慢性器官退行疾病的治療劑。
[0011] Na/K-ATPase在維持細胞、器官和整個身體中電解質和液體平衡中起作用。哺乳動 物細胞的Na/K-ATPase與多種膜及細胞溶膠蛋白質相互作用，由此起到信號傳導受體的作 用。Src是一種非受體酪氨酸激酶，能與Na/K-ATPase形成受體復合物并調節細胞生長、分 化、凋亡和纖維化，見圖1的示意圖。
[0012] 生理濃度的強心類固醇對Src受體復合物的激活在腎臟、心血管功能調節上有重 要作用。此外，Src受體復合物的持續激活導致ROS應激反應，其促進多種疾病的發生，包 括癌癥、高血壓、先兆子癇，終末期腎病，充血性心臟衰竭和糖尿病。
[0013] Na/K-ATPase酶廣泛表達于大多數真核細胞中并對維持跨膜離子梯度至關重要， 其通過將Na +泵出細胞并將K+泵入細胞。在結構上，該酶由兩個非共價連接的a和0亞 基構成。Na/K-ATPase的a亞基具有10個跨膜結構域，其N-和C-末端都位于細胞質中。 a亞基由數個得到良好表征的結構域構成：執行子（A)結構域由N-末端和第二個連接于 跨膜螺旋M2和M3的細胞溶膠結構域（CD2)構成；高度保守的不連續磷酸化（P)結構域靠 近質膜；以及一個相對分離的核苷酸結合（N)結構域。在離子泵循環中，這些結構還顯示有 A和N結構域的顯著運動。在傳輸循環中，A結構域旋轉，而N結構域閉合，這開啟了（El) 并關閉了（E2)A、N和P結構域。
[0014] 先前，本發明人和其他人員已經證明強心類固醇（Cardiotonic Steroid，CTS)如 烏本苷與Na/K-ATPase的結合刺激多個蛋白質激酶的級聯效應。此外，Src的敲除消除了 這些激活效應中的大部分。Src作為Src家族非受體激酶家族的成員之一，在很多細胞外刺 激即細胞因子、生長因子和應激反應的信號轉導通路中起重要作用，而且是特定癌癥和骨 病中進行治療干預的良好革巴標。
[0015] Na/K-ATPase與Src通過至少兩個結合基序直接相互作用：一個基序在a 1亞基 的⑶2和Src SH2之間；另一個涉及到第三細胞溶膠結構域（⑶3)和Src激酶結構域。所 形成的該Na/K-ATPase和Src的復合物起受體作用，由此引發蛋白質激酶的級聯效應。
[0016] 例如，烏本苷與Na/K-ATPase的結合會破壞后者的相互作用然后導致不同通路的 組裝和激活，包括ERK級聯反應、PLC/PKC通路及線粒體中ROS產生。此外，這種相互作用使 Src保持失活狀態。因此，Na/K-ATPase起到內源Src負調節子的作用。見例如共同發明人 的待審申請：美國出版號2011/0245167(出版于2011年10月6日）、PCT/US07/023,011(提 交于2007年10月17日（出版號為W02808/054792, 2008年5月8日），其要求美國序列號 60/855,482(提交于2006年10月16日）的優先權，這些申請明確地通過引用并入本文。
[0017] 有對革巴向新發現的Na/K-ATPase/Src受體復合物，以開發新型受體激動劑或詰抗 劑的需要，使Na/K-ATPase/Src復合物的受體功能可以得到刺激（用于處理如心肌缺血/ 再灌注損傷等疾病）或得到抑制（用于處理組織纖維化、充血性心臟衰竭和癌癥等疾病）。 [0018]因為有著各自自身目的功能結構域形式的相關蛋白質的整個家族都能得到鑒別， 所以這種通用方法將具有極大的適用性。對這些相關蛋白質的了解將極大地幫助我們理解 多種生理學過程，包括細胞生長或死亡、惡變、腎臟/心血管功能及免疫反應。
[0019] 這種方法還有助于不斷發展更加有效的治療性、診斷性或預防性試劑，其具有 更少的副作用。這一點的重要性不斷增加，因為目前人們相信傳統中醫（TCM)用于處理 患者的用途是溫和療法，同時也具有高度的商業性。植物及其提取物一度是治療者用于 處理患者的最重要的物群。世界范圍的人群中有很多仍然嚴重依賴于草藥藥物（herbal medicine)作為其主要的治療來源。而且，目前處方藥物中很多活性組分都是首次在植物中 鑒定出的，而且現今最受歡迎的藥物中有很多來源于植物材料。
[0020] 另外，這種備選的醫療手段得到越來越廣泛的接受，在美國也得到使用，用于處理 廣泛的病況及健康的維持。據估計，兩個美國人中就有一個正不時使用替代療法。具體而 言，患者處理其癌癥的最受歡迎的補充手段或完全的替代手段是使用植物性試劑/草藥。
[0021] 盡管對人類患者施用植物或其提取物的這種方法已經進行了數個世紀，但仍不能 夠確定何種精確的量能提供有效性。即，由于植物的本質是活體形式，所以由于其中有效成 分的量可能不同，使得每個植物都是獨特的。另外，不同的變化情況會導致含有不同量的有 效成分；例如，有人已經注意到如果植物來源于氣候更熱帶的地區，則果實會更辛辣。
[0022] 具體而言，傳統中醫（TCM)經常是患者選擇其他和/或替代手段處理其障礙時的 一種處理模式選項。例如，患者既使用TCM作為抗癌試劑，也用其減輕標準化療的副作用。 然而，TCM缺少西醫所要求的科學健全的方法論，且使用TCM經常有效或無效。
[0023] 仍然有發現特異性草藥提取物（herbal extracts)及其組合的需要，其具有特異 的實用性并且有科學證據證明其能在所述用途中起作用的機制。
[0024] 本發明提供的正是這樣的新型組合物和方法。
[0025] 發明概述
[0026] Na/K-ATPase a 1亞基和Src能形成受體復合物。如圖1中所示，內源的強心類固 醇（CTS)和洋地黃類藥物如烏本苷起激動劑的作用并調動所述受體復合物。隨后，引起下 游蛋白質激酶的級聯效應。通過這些受體Na/K-ATPase/Src復合物激活的這些通路在調控 細胞生長、腎鹽處理和器官重塑方面起重要作用。
[0027] 本文描述的是一種鑒定改變Src活性的化合物的方法，其中所述方法包含：
[0028] i)純化a I Na/K-ATPase 以獲得 Na/K-ATPase，其顯示了高于 800 y mol Pi/mg蛋 白質A的特異活性；
[0029] ii)將步驟（i)中純化的Na/K-ATPase與Src混合，以形成Src活性受抑制的受體 Na/K-ATPase/Src復合物；
[0030] iii)將步驟（ii)中的受體Na/K-ATPase/Src復合物暴露于化合物，其中該化合物 的結合將受抑制的Src從受體Na/K-ATPase/Src復合物中釋放，導致Src活性的增加；以及
[0031] iv)測量Src活性的增加，其中增加的Src活性指示該化合物改變了 Src的活性。
[0032] 在特定實施方式中，所述方法包括確定相比于Src活性的對照水平，是否有Src活 性的增強水平，其中Src活性水平的增強指示該化合物為激動劑，而其中相對于對照水平， Src活性水平的降低指示該化合物為拮抗劑。
[0033] 在特定實施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復合物的激動劑包含強心類固醇。
[0034] 在特定實施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復合物的激動劑包含烏本苷、地高辛、 海蟾蜍毒素（MBG)、油酸、二十二碳六烯酸（DHA)、谷胱甘肽二硫化物（GSSG)和異硫氰酸烯 丙酯中的至少一種或多種。
[0035] 在特定實施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復合物的拮抗劑包含3, 4, 5-三羥基咕 噸酮（MB5)、3,4,5,6-四羥基咕噸酮（MB7)、姜黃素、雙脫甲氧基姜黃素、丹參酮I、丹參素 鈉、黃芪甲苷IV、阿魏酸和丹參酮IIA中的兩種或多種。
[0036]在特定實施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復合物的拮抗劑包括丹參酮I、丹參素 鈉、黃芪甲苷IV和阿魏酸的組合。
[0037] 在特定實施方式中，受體Na/K-ATPase/Src復合物的激動劑可見于黨參、血參根、 丹參（radixsalviamiltiorrhizae)、當歸、西當歸(angelicasinensis)、黃苗和黃耆 (astragalus)中的一種或多種。
[0038] 在特定實施方式中，所述化合物用于處理與心臟肥大、組織纖維化、充血性心臟衰 竭、癌癥、傷口或皮膚損傷中一種或多種相關的障礙。
[0039] 在特定實施方式中，所述化合物被鑒定用于處理某種障礙，所述方法進一步包括： 用該化合物進行測定法，以：i)如果化合物為激動劑，使Src從受體Na/K-ATPase復合物中 釋放；或ii)如果化合物為詰抗劑，阻止Src從受體Na/K-ATPase復合物中釋放；并確定化 合物是否為Src激活劑或非ATP-競爭性的Src抑制劑，其中顯著抑制所述障礙的化合物為 適于處理所述障礙的化合物。
[0040] 在特定實施方式中，所述方法包括診斷受試者是否患有某種障礙，通過：提供來 自受試者的樣品；將樣品與受體Na/K-ATPase復合物相接觸；確定樣品中Src活性的水平 并與參照物相比較，其中與參照物比較Src活性的水平有差異則指示該受試者患有此種障 礙。
[0041] 在特定實施方式中，所述方法評估用于障礙的處理，通過：提供來自受試者的樣 品；將樣品與受體NaA-ATPase復合物相接觸；施用一種或多種劑量的處理；確定樣品中 Src活性的水平，與參照物相比較，其中與參照物比較Src活性的水平有差異則指示所述處 理有效。
[0042] 在特定實施方式中，所述方法包括確定受試者患上某種障礙的并發癥的風險，通 過：提供來自受試者的樣品；將樣品與受體Na/K-ATPase復合物相接觸；確定樣品中Src活 性的水平，與參照物相比較，其中與參照物比較Src活性的水平有差異則指示受試者有患 上該并發癥的風險。
[0043] 在特定實施方式中，所述方法包括確定何時可以終止施用于受試者以處理某種障 礙的處理模式，通過：提供來自受試者的樣品；將樣品與受體Na/K-ATPase復合物相接觸； 確定樣品中Src活性的水平，與參照物相比較，其中Src活性的接近參照物中Src的水平則 指示所述處理可被終止。
[0044] 在特定實施方式中，所述方法包括確定何時可以在受試者中