一種原代肝組織細胞分離系統及分離方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學技術領域，具體是一種原代肝組織細胞分離系統及分離方法。
【背景技術】
[0002]原代肝細胞是肝臟疾病基礎和臨床研宄的重要材料。特別是在臨床中，肝衰竭患者內科保守治療效果不佳，而肝源和高昂經費讓肝移植治療難以惠及大多數病人。人工肝，尤其是生物人工肝是目前肝衰竭有希望的療法，但從肝組織中獲得大量原代肝細胞的方法尚不完善。現有主流的分離方法是通過多種非專用的裝置(如蠕動泵、金屬盆、水浴溫箱)對肝組織灌注含有膠原酶的細胞分離液，使得肝細胞從組織中分離出來。其操作過程繁復，操作條件要求無菌，操作器械多樣，對操作者有較高的技術要求。此外，由于缺乏有效的過濾裝置，即使膠原酶仍有活性，膠原酶也極少重復使用，因此操作過程消耗膠原酶較多，費用高。因此，一種簡便、高效、經濟的肝臟組織細胞分離系統亟待開發。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于提供一種簡便、高效、自動的原代肝組織細胞分離系統及分離方法，為滿足肝病基礎研宄和臨床實踐中生物型人工肝、原代肝細胞的需求，可以持續大量獲得原代肝細胞，以解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0004]為實現上述目的，本發明提供如下技術方案:
一種原代肝組織細胞分離系統，由控制面板、循環泵管路、細胞分離盒和細胞富集瓶組成，
所述控制面板上分別設有顯示屏以及控制儲液管中的磁力攪拌旋鈕、控制循泵旋鈕、水浴鍋溫度控制旋鈕、液壓監測控制旋鈕；
所述循環泵管路包括儲液罐和滾壓式泵，儲液罐通過循環管路連接在滾壓式泵的進口，滾壓式泵出口上連接的循環管路上安裝有液壓溫度監測器，儲液罐內放置有磁力攪拌轉子，儲液罐放置在內恒溫水浴鍋，恒溫水浴鍋放置在磁力攪拌裝置上；
所述細胞分離盒的兩端分別設有第一螺旋接口和第二螺旋接口，第一螺旋接口與滾壓式泵出口的循環管路連接，細胞分離盒的內部前端設有與第一螺旋接口連接的多項接頭，所述細胞分離盒內設有孔徑依次減小的第一篩網、第二篩網和第三篩網，所述第一篩網與多項接頭之間設有組織灌注槽；
所述細胞富集瓶包括富集瓶體，富集瓶體頂端通過富集瓶導管接第二螺旋接口，富集瓶導管上安裝有富集瓶上開關，富集瓶體內設有細胞篩，富集瓶體下端通過分離瓶下導管連接在儲液罐內，分離瓶下導管上安裝有富集瓶下開關。
[0005]作為本發明進一步的方案:所述細胞分離盒的構型為一個由窄至寬的立體梯形，且第一螺旋接口設置在細胞分離盒的窄端，第二螺旋接口設置在細胞分離盒的寬端。
[0006]作為本發明再進一步的方案:所述第一篩網的孔徑為300目，第二篩網的孔徑為200目，第三篩網的孔徑為100目。
[0007]一種原代肝組織細胞分離系統的分離方法，具體步驟如下:
(1)通過控制面板掌控系統的運行，保證工作環境的調控及監測；
(2)將新鮮采集的無菌肝組織樣本放入細胞分離盒內的組織灌注槽內，若組織塊較大，則分割成小塊后放入多個細胞分離盒中，多個細胞分離盒并聯同時運行；
(3)根據組織情況，把多項接頭連接上導管或者穿刺針，對肝組織樣本進行門脈連接或者多點穿刺；
(4)在儲液罐中加入無菌生理鹽水，并調節控制面板上的溫度控制旋鈕調控儲液罐中生理鹽水的溫度至37°C，打開循環泵控制旋鈕控制滾壓式泵啟動，使生理鹽水對肝組織進行初步灌注清洗2min，排除腔隙中的血細胞以及雜質；
(5)把第一篩網、第二篩網和第三篩網按順序插入細胞分離盒的相應卡槽中，扣上盒蓋，并將儲液罐清洗干凈，置換無菌細胞分離液；
(6)再次打開磁力攪拌旋鈕、溫控控制旋鈕和循環泵控制旋鈕，儲液罐中的細胞分離液充分混勻，并加熱至37°C，隨循環泵管路進入細胞分離盒，通過細胞分離盒前部的多項接頭，分別有三個導管或者穿刺針對肝細胞進行持續灌注，細胞分離液與肝組織充分接觸同時伴有持續穩定的灌注壓；
(7)分離下來的肝細胞及組織隨循環液依次流經第一篩網、第二篩網和第三篩網，將單細胞懸液匯聚細胞富集瓶中，含有膠原酶的細胞分離液分離循環回儲液罐中；
(8)待肝組織細胞分離完畢，先關閉循環泵控制旋鈕，再關閉富集瓶上開關和富集瓶下開關，取下富集瓶體，完成原代細胞分離。
[0008]與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明系統將原代肝細胞分離過程集合在一整套系統中，保證整個分離過程的封閉無菌狀態下進行，同時使分離條件因素能被精確的控制，保證穩定的灌注壓，多點灌注位置，循環利用含有膠原酶的灌注液；同時分離盒、富集瓶及管路系統可以作為一次性無菌耗材制備，降低成本，方便實用；本發明有助于為科學研宄及生物人工肝，提供大量優質的原代肝細胞。
【附圖說明】
[0009]圖1為原代肝組織細胞分離系統的結構示意圖。
[0010]圖2為原代肝組織細胞分離系統中細胞分離盒的內部結構圖。
[0011]圖中:1_顯不屏；2_液壓監測旋鈕；3_溫度控制旋鈕；4_循環栗控制旋鈕；5_磁力攪拌旋鈕；6_恒溫水浴鍋；7_磁力攪拌裝置；8_儲液罐；9_滾壓式泵泵；10-液壓溫度監測器；11_循環管路；12_前旋入接口 ；13_多項接頭；14_組織灌注槽；15_第一網篩；16_第二網篩；17_第三網篩；18_后旋入接口 ；19_富集瓶導管；20_富集瓶上開關；21_富集瓶體；22_細胞篩；23_富集瓶下開關；24_分離瓶下導管；25_循環泵管路；26_控制面板；27-細胞富集瓶；28_細胞分離盒。
【具體實施方式】
[0012]下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0013]請參閱圖1?2，本發明實施例中，一種原代肝組織細胞分離系統，由控制面板26、循環泵管路25、細胞分離盒28和細胞富集瓶27組成。
[0014]控制面板26上分別設有顯示屏I以及控制儲液管中的磁力攪拌旋鈕5、控制循泵旋鈕4、水浴鍋溫度控制旋鈕3、液壓監測控制旋鈕2，顯示屏I實時顯示系統中的液壓、溫度及控制旋鈕的設定參數。
[0015]循環泵管路25包括儲液罐8和滾壓式泵9，滾壓式泵9是一個4cm正方形軸與
4.2cm直徑的圓周組成，其正方形四角擠壓通過圓周的管路形成泵壓；滾壓式泵9通過調節泵頭轉動擠壓循環管路11驅動儲液罐8中的含有膠原酶的細胞分離液循環流動，并提供持續的肝組織灌注壓力；儲液罐8通過循環管路11連接在滾壓式泵9的進口，循環管路11采用直徑為0.5cm的透明軟管，滾壓式泵9出口上連接的循環管路11上安裝有液壓溫度監測器10，儲液罐8內放置有磁力攪拌轉子7，儲液罐8放置在內恒溫水浴鍋6，恒溫水浴鍋6放置在磁力攪拌裝置上，儲液罐中的磁力攪拌轉子7工作時保證循環使用的膠原酶濃度，同時也能使恒溫水浴鍋對含有膠原酶的細胞分離液均勻恒溫，使膠原酶發揮最佳效果。
[0016]在管路系統中的液壓溫度監測器10，可以對系統運行狀態進行監測，其中溫度監測保證細胞分離液的最佳工作溫度；液壓監測是明確管路通暢的重要指標，并且指示篩網是否阻塞嚴重，可暫停運行，置換篩網，繼續工作。
[0017]細胞分離盒28的構型為一個由窄至寬的立體梯形，封閉無菌，運行過程避免環境的干擾，上底為3cm，下底為9cm，縱軸長11cm，細胞分離盒28的兩端分別設有第一螺旋接口12和第二螺旋接口 18，且第一螺旋接口 12設置在細胞分離盒28的窄端，第二螺旋接口 18設置在細胞分離盒28的寬端。
[0018]第一螺旋接口 12與滾壓式泵9出口的循環管路11連接，細胞分離盒28的內部前端設有與第一螺旋接口 12連接的多項接頭13，多項接頭13可以根據不同組織需求連接不同數量的導管或者穿刺針，進行多點穿刺灌注，有利于細胞分離液在組織中充分浸潤，發揮作用。
[0019]細胞分離盒28內設有孔徑依次減小的第一篩網15、第二篩網16和第三篩網17，第一篩網15的孔徑為300目，第一篩網15主要目的是阻截