小花山小橘中分離的抗蟲成分的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種從植物小花山小橘中分離的抗蟲成分，包括粗提物和一種新化合 物。
【背景技術】
[0002] 小花山小橘（G. parviflora (Sims)Kurz),蕓香科山小橘屬，為灌木或小喬木。小 花山小橘的根及葉可以作草藥，其味苦，微辛，氣香，性平。其中根行氣消積，化痰止咳；而葉 則有散瘀消腫的功效。可用于感冒咳嗽，胃腹脹痛，消化不良，跌打瘀痛，風濕關節痛等。對 于小花山小橘，不論該植物本身，或其分離出的化學成分的生物活性的研究，都少有報道。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的是從天然植物中提取分離出具有害蟲拒食性的新物質。
[0004] 本發明發現小花山小橘的提取物具有害蟲拒食性。
[0005] 本發明采用硅膠柱層析方法，從小花山小橘提取分離出一種新化合物--式I，經 鑒定，其化學結構式如下所示：
[0006]
[0007] 式 I 的化學命名是 3_amin〇-6, 8-dimethoxy-3-(2-〇xopropyl)-[l, 5] dioxocane_2, 4, 7_trione，（ 3_ 氣基 _6, 8_ 二甲氧基 _3_ (2_ 撰基丙基）_[1，5] 二氧八 環-2, 4,7_三酮）。
[0008] 將式I化合物進行赤擬谷盜成蟲拒食實驗證實，式I具有對害蟲的拒食活性功能。
[0009] 可將式I化合物制成各種藥物可接受的鹽和制劑，用于制備抗蟲制品。
[0010] 經試驗證實，式I化合物對害蟲拒食效果較為顯著(見實施例)。
[0011] 本發明優點：
[0012] 式I化合物是從小花山小橘植物中提取，在自然條件下易分解，不會引起生物富 集現象，并且對人畜安全，可以作為天然農藥長期使用而不會產生環境污染的問題。
【附圖說明】
[0013] 圖1是式I化合物的IH-NMR譜圖；
[0014] 圖2是式I化合物的COSY譜圖；
[0015] 圖3是式I化合物的HSQC譜圖；
[0016] 圖4是式I化合物的HMBC譜圖；
[0017] 圖5是式I化合物的APT譜圖；
[0018] 圖6是式I化合物的ESI譜圖。
【具體實施方式】
[0019] 式I化合物的分離
[0020] 儀器：
[0021] Bruker ACF300和AMX500超導核磁共振儀，瑞士 Bruker公司；
[0022] 玻璃色譜柱：直徑與長度 85 X 550mm，40 X 400mm、35 X 400mm、30 X 400、 25 X 400mm、20 X 350mm，購于北京博美玻璃有限公司。
[0023] 材料與試劑：
[0024] 層析硅膠（200-300目）采自青島海洋研究所，
[0025] 薄層層析硅膠GF254購于青島海洋化工有限公司；
[0026] 石油醚、乙酸乙酯、乙醇、丙酮等均購自北京化學試劑公司；
[0027] 95%酒精采購自北京廣達恒益有限公司。
[0028] 分離方法
[0029] 1小花山小橘乙醇提取物一級硅膠柱層析分離
[0030] 首先采用薄層層析確定起始洗脫劑。將樣品用丙酮稀釋，用毛細管點樣于GF254 薄層板上，在層析缸中加入1ml按一定比例配比的石油醚：乙酸乙酯：無水乙醇洗脫劑。將 點好樣品的薄層板放入層析缸中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊〇. 3-0. 5cm，蓋上缸 蓋，待展開至距薄層板上沿0. 5-1. Ocm時，取出薄層板，用電吹風吹干溶劑，在紫外燈下觀 察展開情況，隨后將薄層板放入碘缸中顯色，當最前沿斑點的Rf值在〇. 2~0. 3時，即可確 定此展開劑為起始洗脫劑。
[0031] 采用濕裝法裝柱，將玻璃色譜柱（85 X 550mm)垂直固定在鐵架臺上，在柱的下端塞 少許脫脂棉花，倒入一藥匙石英砂，防止硅膠泄漏。將200~300目硅膠放入燒杯中，加入 適當量的洗脫劑，經充分攪拌，將硅膠內的氣泡除去后再加入柱內，一邊沉降一邊添加。硅 膠加完后，仍使洗脫劑流滴一段時間，然后使色譜柱中高于硅膠面上的洗脫劑幾乎全部流 入接受瓶內。然后用橡皮塞在色譜柱外敲打，將硅膠柱內的氣泡趕凈。色譜柱裝好后，使其 靜置過夜，以壓實硅膠，提高分離效果。
[0032] 樣品的加入，采用干法加樣。待硅膠柱靜置過夜后，先將色譜柱中硅膠面上的多余 洗脫劑放出，丙酮溶解樣品加入適當量的200-300目硅膠拌勻，攪拌或者在用吹風機吹干 溶劑成粉末狀，用小勺將拌勻后的樣品緩慢加入色譜柱中。樣品加入后，用滴管吸取少量洗 脫劑緩緩沖洗色譜柱壁，打開活塞將洗脫劑慢慢放出，待柱面上沒有洗脫劑時，將一塊脫脂 棉平鋪于柱面，壓上玻璃棒，防止加入洗脫劑時破壞色譜柱面，加入洗脫劑后，開始分離。
[0033] 洗脫劑采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇，按極性從小到大梯度洗脫，采用等餾分收集 法（500mL)收集，使用旋轉蒸發儀回收溶劑，在回收過程中將餾分經薄層層析（TLC)檢驗后 將成分相同或相似者合并。洗脫時先加起始洗脫劑，每個洗脫劑梯度一般收集5-6個500mL 餾分，按從小到大增加洗脫劑(石油醚：乙酸乙酯：無水乙醇）極性。加到50%無水乙醇后， 當收集5-6個收集瓶后，洗脫劑不再倒回色譜柱內，待到柱內表面沒有溶劑時，加入無水乙 醇洗脫，收集5-6個收集瓶時，洗脫劑不再倒回色譜柱內，待到柱內表面沒有溶劑時，加入 水洗脫，洗脫下來的溶液用三氯甲烷萃取，萃取液經旋轉蒸發儀回收試劑。小花山小橘乙醇 提取物經一級柱層析分離，并通過薄層層析檢測合并后相同的組分，然后繼續進行二級硅 膠柱層析分離。
[0034] 2小花山小橘乙醇提取物二級硅膠柱層析分離
[0035] 采用薄層層析檢驗，確定各部分起始洗脫劑。方法同3. 2. 1。
[0036] 采用濕法裝柱，玻璃色譜柱規格為35 X 400mm，30
[0037] X 400mm，40 X 400mm，其余同 3. 2. 1 方法。
[0038] 樣品的加入，采用干法加樣。方法同3. 2. 1。
[0039] 二級柱層析分離采用等梯度洗脫，按等餾分收集法（150mL)收集，使用旋轉蒸發儀 回收溶劑，經薄層層析（TLC)檢驗后將成分相同或相似者合并。當活性成分成功洗脫后，洗 脫液不再倒回色譜柱內，待到柱內表面沒有溶劑時，加入無水乙醇洗脫，收集4-5個收集瓶 后，洗脫液不再倒回色譜柱內，直到沒有洗脫液可收集。
[0040] 3NMR 和 MS 分析
[0041] 將樣品用氘代氯仿（CDC13)溶解，加入核磁管