一種耐有機溶劑半乳糖苷酶高產菌以及該半乳糖苷酶的基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種耐有機溶劑半乳糖苷酶高產菌，其耐有機溶劑半乳糖苷酶，以及 一種以乳糖為供體酶法半乳糖基化核苷類化合物的方法，屬于生物制藥技術領域。 技術背景
[0002] 疊氮胸苷、阿昔洛韋等核苷類藥物是一類重要的抗腫瘤、抗病毒藥物，廣泛應用于 臨床治療各種癌癥。疊氮胸苷是第一個抗HIV病毒藥物，阿昔洛韋則是目前臨床上最有效 的抗I型和II型單純皰瘆病毒之一，對急性視網膜壞死水痘帶狀皰瘆病毒和EB病毒等其 他皰瘆病毒也有療效。然而，疊氮胸苷由于高血漿濃度而引發較強的毒副作用，阿昔洛韋則 會對血液系統、神經系統、消化系統等具有一定的毒副作用。為了獲得最佳治療效果和較小 毒副作用，可以對疊氮胸苷等核苷類藥物進行糖基化修飾。糖基化是一類重要的改性修飾 反應，不僅會改變化合物的生物活性、水溶性、穩定性、在細胞內的運輸特性、亞細胞定位以 及特異性傳遞等特性，另外還能降低化合物的毒性。研宄表明（Abram R.，Aman N.，von Borstel R.，Cell Biophysics, 1994，24-25 (I) :127-133) 5-氟尿苷的半乳糖衍 生物（5' -半乳糖基-5-氟尿苷）的毒副作用比母藥5-氟尿苷低100倍。Bonina等 (Bonina, F. , Puglia, C. ; Rimoli, M. G. ; Aval lone, L. , Abignente, E. ; Boatto, G. ; Nieddu, Μ. ; Meli, R. ; Amorena Μ. ; de Caprariis, Ρ. Eur. J. Pharm. Sci., 2002，16(3): 167-174)也報道了疊氮胸苷的半乳糖基衍生物不僅可以降低疊氮胸苷的血 漿濃度，而且可以保持有效濃度更長時間，避免頻繁給藥。
[0003] 目前，核苷糖基化衍生物主要通過化學法合成，但由于兩底物中均存在多個活 性羥基或氨基，化學法的選擇性并不理想，所以二糖核苷的合成需要多步的保護/脫保 護步驟，工藝非常復雜。而酶法糖基化一般只需一步反應，反應條件溫和，具有很高的 區域選擇性和化學選擇性。然而，有關用糖苷酶催化核苷糖基化反應的報道并不多。 Binder 等(Binder ff.H. , Kiihlig Η. , Schmid ff. Tetrahedron:Asymmetry, 1995, 6(7):1703-1710)利用來源于米曲霉的β-半乳糖苷酶通過轉糖基反應催化底物對硝基 苯基-β-D-半乳糖苷（/7NPG)和四種天然核苷（2' -脫氧尿苷、尿苷、胸苷和腺苷）合成 了一系列含半乳糖基的二糖核苷衍生物，但收率僅為3-7 %，區域選擇性很差。Andreotti 等（Andreotti G. , Trincone A. , Giordano A. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007，47(1-2) :8-32)利用來源于海洋軟體動物黑指紋海兔胰腺的β-半乳 糖苷酶，以鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷（〇NPG)為糖基供體，催化疊氮胸苷半乳糖基化生成 5'-仏β-半乳糖基-疊氮胸苷，產率達到了 43 %，但其對底物的轉化率僅為21. 5 %。顏麗 強等人（Yan L Q, Li Ν, Zong M Η. Journal of Biotechnology, 2012，164(2):371-375) 利用牛肝β-半乳糖苷酶以oNPG為供體進行了阿昔洛韋等無環核苷的半乳糖基化反應，但 是對底物的轉化率僅有13 %，而且底物濃度僅為0.01 M。
[0004] 雖然說在過去幾年中生物法糖基化修飾核苷類藥物取得了一定的突破與進展，但 仍存在一些問題亟需解決。目前酶法糖基化修飾核苷類藥物的糖基供體主要是oNPG或者 是/7NPG，這些相比較于寡糖來說，其價格昂貴，實際的應用價值較低。而通常的酶法催化在 水中進行，而要修飾阿昔洛韋等不溶于水或者難溶于水的化合物時，低產率及低轉化率也 成為糖基化修飾的另一瓶頸。近年來不斷發展的非水相催化可以很好的克服底物水溶性差 的問題，還可以對產物進行一定程度的調控，如果再以寡糖為糖基供體，將能很好地克服目 前生物法糖基化修飾核苷類藥物存在的問題。因此，篩選以寡糖為糖基供體在非水相中糖 基化修飾核苷類藥物的半乳糖苷酶具有重要意義。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的針對目前糖基化修飾核苷類藥物存在的糖基供體價格昂貴、糖基化 反應轉化前底物濃度低、產物摩爾轉化率也較低等問題，提供一種有機溶劑耐受性好、以乳 糖為糖基供體的β -半乳糖苷酶及其產生菌，含有編碼該酶基因的重組表達載體、重組表 達轉化體及其高效制備方法，以及一種以乳糖為供體酶法半乳糖基化核苷類化合物的方 法。
[0006] 為了實現本發明的目的，本發明首先從本實驗室耐有機溶劑菌庫中篩選獲得一株 耐有機溶劑β -半乳糖苷酶產生菌，分類命名為干酪乳桿菌YZ09(L3cic^aciT7w5· casei YZ09)，其保藏編號為 CCTCC :M 2014540。
[0007] 本發明對干酪乳桿菌casei YZ09的生物學特征進行鑒定，該菌株 為革蘭氏陽性菌株，無芽孢的桿菌，兼性厭氧，最適生長溫度為30~40°C。其生理生化特性 表現在：過氧化氫酶反應結果為陰性，明膠反應結果為陰性，無運動，氧化葡萄糖產酸，可利 用乳糖、蔗糖、山梨醇、木糖、果糖、麥芽糖、甘露醇等。
[0008] 經16S rDNA序列分析，該菌株鑒定為ZacioAaciBw1S casei。
[0009] 本發明對該耐有機溶劑半乳糖苷酶產生菌YZ09進行了產酶優化，優化后產酶量 達到了 6. 58 U/mL 本發明分離克隆到c<asi?iYZ09菌株所產耐有機溶劑半乳糖苷酶GAL的 編碼基因，它具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，為此基因的改造并在各種外源基因表達 系統中高效表達提供了優良的基因材料。通過PCR法分離克隆了這一耐有機溶劑半乳糖苷 酶GAL基因，DNA全序列分析結果表明，該耐有機溶劑糖苷酶GAL基因全長1797個核苷酸， 編碼598個氨基酸。
[0010] 本發明構建了耐有機溶劑半乳糖苷酶GAL基因的表達載體。它可以通過本領域常 規方法將本發明所述基因連接于各種載體上構建而成。所述的載體可為本領域常規的各種 載體，如市售的質粒、粘粒、菌體或病毒載體等，優選pET28a。較佳的，可通過下述方法制 得本發明的重組表達載體：將通過PCR擴增所得的產物用限制性內切酶BamH I和Sal I 進行雙酶切，形成互補的粘性末端，同時將載體pET28a用限制性內切酶BamH I和Sal I 雙酶切，經T4 DNA連接酶連接，形成含有本發明的β-半乳糖苷酶基因的重組表達載體 ρΕ?-galo
[0011] 本發明將上述重組表達載體轉化至宿主細胞制得重組表達轉化體。所述的宿主可 為本領域常規的各種宿主，只要能滿足重組表達載體可穩定地自行復制，且所攜帶的本發 明的β-半乳糖苷酶基因可被有效表發即可。本發明優選大腸桿菌，更優選大腸埃希氏菌 (萬.co7i) JM109 (DE3)。將前述重組表達質粒pET-^a7轉化至（萬.co7i) JM109 (DE3)中， 即可得本發明優選的基因工程菌株，即大腸埃希氏菌（萬.cWi) JM109 (DE3)/pET-辟人
[0012] 本發明還提供一種重組β-半乳糖苷酶的制備方法，其包括如下步驟：培養本發 明前述的重組表達轉化體，獲得重組表達的β_半乳糖苷酶。其中，所述的培養重組表達 轉化體中所用的培養基可為本領域常規的任何可使轉化體生長并產生本發明的β-半乳 糖苷酶的培養基，優選LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7. 0。培 養方法和培養條件沒有特殊的限制，可以根據宿主類型和培養方法等因素的不同按本領域 普通知識進行適當的選擇，只要是轉化體能夠生長并產生本發明所述的β -半乳糖苷酶即 可。其他培養轉化體的具體操作均可按本領域常規操作進行，優選下述方法：將本發明涉及 的重組大腸桿菌JM109 (DE3) /pET-gW接種至含卡那霉素的LB培養基中培養，當培養液的 光密度〇D_達到0. 6-1. 0時，在終濃度為0. 1-1. 0 mmol/L的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳 糖苷（IPTG)的誘導下，高效表達本發明的重組β-半乳糖苷酶。
[0013] 本發明中催化乳糖和核苷類藥物轉糖基得到半乳糖基核苷類衍生物的催化劑，可 以是上述產生的重組β -半乳糖苷酶的轉化體的培養物，也可以是通過將培養基離心分離 后得到的轉化體細胞。
[0014] 另一方面，本發明提供一種以乳糖為供體酶法半乳糖基化核苷類化合物的方法。 該方法包括將具有本發明半乳糖基化酶活力的物質加入含有核苷類化合物的轉化夜中，進 行生物轉化反應，使核苷類化合物轉化為半乳糖基核苷類衍生物，所述轉化液中含有核苷 類化合物和糖基供體，所述核苷類化合物為疊氮胸苷、阿昔洛韋，所述糖基供體為乳糖。
[0015] 優選地，所述具有半乳糖基化酶活力物質包括具有半乳糖基化酶活力的發酵液、 發酵液上清、純化的半乳糖基化酶和半乳糖基化酶重組表達蛋白。
[0016] 優選地，所述半乳糖基化酶為半乳糖苷酶，更優選地，所述半乳糖苷酶為 本發明中菌株ΥΖ09所產β-半乳糖苷酶或其重組表達蛋白。
[0017] 優選地，所述反應在非水