糞便乳桿菌fzb1及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種糞便乳桿菌及其應用，屬于微生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 乳桿菌屬（Lactobacillus)是生活在碳源豐富環境的乳酸菌（Lactic acid bacteria)的主要代表，被視為安全無害的微生物。乳桿菌廣泛分布于植物體表、傳統發 酵食品、乳制品、人和動物腸道中，對動物和人類都有益生作用。乳桿菌在宿主腸道中能 產生乳酸等代謝產物，拮抗病原菌的生長繁殖、、改善腸道菌群失調、降低血清膽固醇、促 進腸道消化系統健康、治療腹瀉、增強免疫力、幫助吸收營養成分，是重要的胃腸道益生菌 (Probiotics)。已經證實乳桿菌對過敏、消化道疾病、呼吸道疾病和陰道炎癥等都有良好的 療效，對繁殖和早期免疫有促進作用。乳桿菌桿菌都具有益生的功能，但是其是否可以作為 益生菌，在腸道中定植存活，取決于其是否耐酸耐膽鹽。
[0003] 奠便乳桿菌（Lactobacillus faecis)是在2013年命名的乳桿菌新種，分離自南 非開普敦動物園中的豺和浣熊的糞便，模式種為AFL13-2T( = JCM 17300T= DSM23956T)，目 前糞便乳桿菌僅有此一例報道，其耐酸和耐膽鹽的性能未知。
【發明內容】
[0004] 本發明提供了一種新的糞便乳桿菌菌株及其應用。
[0005] 本發明提供了一種糞便乳桿菌，它是由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心保藏的保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)。
[0006] 本發明的糞便乳桿菌FZBl (Lactobacillus faecis FZB1)，于2015年2月2日保 藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，其地址為：北京市朝陽區 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所，其保藏號為：CGMCC No. 10515。
[0007] 本發明還提供了保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)在制備益生菌中的用途。
[0008] 本發明提供了保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)在制備抑菌、改善腸道菌群失調、降低血清膽固醇、促進腸道消化系統健康、 治療腹瀉、增強免疫力、幫助吸收營養成分的藥品、保健品、食品或者飼料添加劑中的應用。
[0009] 本發明還提供了一種藥品，它是以保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)為活性成分，加上藥學上可接受的輔助性成分制備而 成的制劑。
[0010] 本發明還提供了一種食品，它是以保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)為活性成分，加上食品上可接受的輔助性成分制備而 成的制劑。
[0011] 本發明還提供了一種保健品，它是以保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)為活性成分，加上保健品上可接受的輔助性成分制備 而成的制劑。
[0012] 本發明還提供了一種飼料添加劑，它是以保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)為活性成分，加上飼料上可接受的輔助性成分制備而 成的制劑。
[0013] 本發明奠便乳桿菌FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)屬于乳桿菌，具有益生特 性，同時其具有耐酸耐膽鹽性能，可以作為益生菌使用，應用前景良好。
[0014] 本發明奠便乳桿菌FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)，是一種分離的全新的菌 株，本發明是糞便乳桿菌物種的第二次發現并分離鑒定。該菌株的分離鑒定豐富了可利用 微生物資源庫，為以后更好地利用乳桿菌做出了一定的貢獻。
[0015] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0016] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0017] 圖1糞便乳桿菌FZBl菌株的16S rDNA序列系統進化樹圖。構建方法為鄰接法， 自舉檢驗值設為l〇〇〇，Lactobacillus kimchiensis L133T設置為外群，標尺為1%的序列 差異。
[0018] 圖2糞便乳桿菌FZBl菌株的RpoA氨基酸殘基序列系統進化樹圖。構建方法為鄰 接法，自舉檢驗值設為1000,短乳桿菌（Lactobacillus brevis)設置為外群，標尺為2%的 序列差異。
【具體實施方式】
[0019] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照試劑盒 說明書選擇。
[0020] 實驗材料：從四川省富順縣張壩村采集白鷺糞便樣品5份。乳桿菌菌株培養方法 為用MRS培養基在37°C靜置培養18-48h。質粒提取試劑盒與膠回收試劑盒購自Omega公 司（Bio-Tek USA)，革蘭陽性菌基因組提取試劑盒、PCR(Ex Taq)和T載體試劑盒購自大連 寶生物公司（TaKaRa)。細菌微量生化管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。
[0021] 實施例1本發明奠便乳桿菌FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)的分離鑒定
[0022] 1、分離方法
[0023] 2010年6月，從四川省富順縣張壩村采集白鷺糞便樣品5份，將白鷺糞便樣品在 MRS培養基上劃線培養，然后挑取生長的單菌落進行革蘭染色觀察。挑取微量革蘭陽性桿菌 菌株的菌體，作為PCR擴增的模板。然后根據乳桿菌PCR快速檢出技術所描述的方法進行 PCR，快速篩出乳桿菌菌株。
[0024] 篩選所用培養基：MRS培養基。
[0025] 培養方法：37°C靜置培養18-48h。
[0026] 通過在MRS培養基上的劃線分離和革蘭染色鑒定，從5份白鷺糞便樣品得到4株 革蘭陽性桿菌。使用乳桿菌PCR快速檢出技術，從4株革蘭陽性桿菌中篩出1株乳桿菌，命 名為FZBl菌株。
[0027] 2、鑒定方法
[0028] (1)形態學特征
[0029] 從固體培養基上挑取單個菌落，進行革蘭染色，然后在顯微鏡下放大2000倍觀察 菌體形態。
[0030] (2)生理生化特征
[0031] 過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗、硫化氫產生試驗和吲哚產生試驗采用傳統方法 進行。D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖和D-甘露醇的發酵產酸試驗 使用細菌微量生化管進行，培養方式為37°C靜置培養。
[0032] 乳桿菌屬的生理生化特征為不產生過氧化氫酶，不液化明膠，不產生硫化氫和吲 哚，代謝葡萄糖產酸。不同乳桿菌菌種代謝不同種類的單糖。
[0033] (3)分子生物學特征
[0034] 測序：細菌有些基因高度保守，例如16S rDNA基因；有的基因在同一菌屬內有較 高的保守性，例如依賴于DNA的RNA聚合酶α亞基基因（rp〇A)和重組酶A基因（recA)。 利用這些保守基因序列，可以鑒定細菌的種屬。
[0035] 培養篩出的乳桿菌菌株，得到菌液，用革蘭陽性菌基因組提取試劑盒提取基因組。 利用細菌16S rDNA通用引物對（正義：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；反義：
[0036] 5' -AAGGAGGTGATCCAG CCGCA-3'），擴增乳桿菌菌株的 16S rDNA 基因。根據 Endo 等人設計的方法，PCR擴增乳桿菌菌株recA基因的保守序列，引物為：正義：
[0037] 5, -GCCCTAAAAAARATYGAAAAGAAHTTYGGTAAAGG-3 ;反義：
[0038] 5' -AATGGTGGCGCYACYTTGTTTTTHACAACTTT-3'。使用 Sabri M. Naser 等人設計的方 法擴增乳桿菌菌株的rpoA基因保守序列，引物為：正義：
[0039] 5' -ATGATYGARTTTGAAAAACC-3' ；反義：5' -ACHGTRTTRATDCCDGCRCG-3'。所有 PCR 擴 增片段均通過膠回收純化，然后進行A-T克隆，最后送到成都擎科梓熙生物技術有限公司 測序。
[0040] 序列比對與系統進化樹構建：利用NCBI網站上的序列比對工具BLAST，在Genbank 等數據庫中比對乳桿菌菌株16S rDNA、recA和rpoA基因的擴增片段的測序結果。系統進 化樹構建使用軟件MEGA 6. 06進行，構建方法為鄰接法，自舉檢驗值設為1000。
[0041] 3、鑒定結果
[0042] (1)形態學特征
[0043] 革蘭染色陽性，菌體呈桿狀，符合乳桿菌屬的特征。
[0044] 在MRS固體培養基上菌落呈乳白色，表面光滑；革蘭氏染色證明分離的菌株為單 一的革蘭氏陽性菌，菌體呈紫紅色桿狀，兩個或多個排列。
[0045] (2)生理生化特征
[0046] 糞便乳桿菌FZBl的生化試驗結果（表1)符合乳桿菌屬的特征，不產生過氧 化氫酶、硫化氫和吲哚，不液化明膠。比較糞便乳桿菌模式種AFL13-2 T( = JCM 17300τ = DSM23956T)的生化特征，僅發酵D-半乳糖產酸的實驗結果不同，但同于糞便乳桿菌 AFL18-5和AFL19-3菌株。生化試驗結果符合分子鑒定的結論。
[0047] 表1糞便乳桿菌FZBl生化特性鑒定表
[0048]
【主權項】
1. 一種糞便乳桿菌，其特征在于：它是由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心保藏的保藏號：CGMCC No. 10515 的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)。
2. 保藏號：CGMCC No. 10515 的糞便乳桿菌FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)在制備 益生菌中的用途。
3. 保藏號：CGMCC No. 10515 的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)在制 備抑菌、改善腸道菌群失調、降低血清膽固醇、促進腸道消化系統健康、治療腹瀉、增強免疫 力、幫助吸收營養成分的藥品、保健品、食品或者飼料添加劑中的應用。
4. 一種藥品，其特征在于：它是以保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)為活性成分，加上藥學上可接受的輔助性成分制備而 成的制劑。
5. -種食品，其特征在于：它是以保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)為活性成分，加上食品上可接受的輔助性成分制備而 成的制劑。
6. -種保健品，其特征在于：它是以保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)為活性成分，加上保健品上可接受的輔助性成分制備 而成的制劑。
7. -種飼料添加劑，其特征在于：它是以保藏號：CGMCC No. 10515的糞便乳桿菌 FZBl (Lactobacillus faecis FZBl)為活性成分，加上飼料上可接受的輔助性成分制備而 成的制劑。
【專利摘要】本發明公開了一種糞便乳桿菌，它是由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏的保藏號：CGMCC No.10515的糞便乳桿菌FZB1(Lactobacillus faecis FZB1)。本發明糞便乳桿菌FZB1(Lactobacillus faecis FZB1)屬于乳桿菌，具有益生特性，同時其具有耐酸耐膽鹽性能，可以作為益生菌使用，應用前景良好。CGMCC No.02
【IPC分類】C12N1-20, C12R1-225, A61K35-747, A23K1-16, A61P1-00, A23L1-29
【公開號】CN104877946
【申請號】CN201510337232
【發明人】潘渠, 余小平, 彭云, 蘇森森, 王海娟, 戴雨珂
【申請人】成都醫學院
【公開日】2015年9月2日
【申請日】2015年6月17日