一種可用于微滴數字pcr的微滴制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子診斷領域，主要應用于數字微滴PCR中的微滴制備或其它PCR中。
【背景技術】
[0002]傳統的反相微乳液法制備的納米微球粒徑一般在10-100納米左右，不僅粒度小，而且中空。其多應用于在其表面進行化學修飾。本發明提供了一種新方法的建立，在改進的反相微乳液方法的基礎上通過水入油時油水不互溶的性質形成一個個單分散的油包水微滴，粒徑大約在10-100 μ m之間，由于內含水溶液，可以作為許多生化反應的微容器。
[0003]傳統的PCR方法是在PCR水溶液里進行，由于模板之間，引物之間會產生同源堿基序列互補而導致PCR的非特異性條帶的擴增，往往增加了假陽性的產生。本發明在微滴制備的基礎上，將PCR反應時的模板，引物，Taq酶和PCR mix通過水入油的方式進入形成包含PCR反應產物的微滴，并進行PCR反應。由于被包含的PCR反應產物在單個獨立的微滴反應器中反應，降低了非特異性反應的發生。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種PCR實驗中油包水微滴及其制備方法，主要應用于目前數字微滴PCR實驗中PCR反應液的包裹。通過不同的水相、油相成分的配比，不同的操作條件，便捷地配制一種具有顆粒均勻、熱力學性能穩定的油包水反應微滴，簡便了 PCR實驗的操作，以及實驗結果的精確性。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的，一種可用于數字微滴PCR的油包水微滴，包括如下步驟:
[0006]SI配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix,以及雙蒸水；將上述藥品以此均勻混合，作為反應水相備用，上述構成的配合比例關系為(0.8-1):(0.8-1): (0.1-0.2): (10-15): (35-40);將上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix依次均勻混合，滴加雙蒸水后將溶液體系作為反應水相備用；
[0007]S2 配制 PCR 油相，將 95 % -98 % 的丙三醇、0.1 % -0.5 % 的 Trit1n X-100、
0.1% -0.5%的Tween-80、0.5% -1%的壬基苯基醚IgelC0520依次均勻混合，獲得的溶液作為反應油相備用；
[0008]S3取I體積水相PCR加到2體積的PCR油相中，渦旋攪拌并反應，得到油包水微滴；
[0009]所述油包水微滴的粒徑10-100微米。
[0010]所述油相體系中丙三醇、Trit1nX-100、Tween-80、壬基苯基醚IgelC0520的配比為(95-98): (0.1-0.5): (0.1-0.5): (0.5-1)。
[0011]所述水相逐滴加入油相，同時渦旋攪拌。
[0012]所述水相一次性加入油相，并且渦旋攪拌。
[0013]所述水相和油相的體積比為1:2。
[0014]渦旋攪拌的時間為4-6min，反應時間為14_16min。
[0015]本方法中Trit1n X-100、壬基苯基醚IgelC0520作為表面活性劑、Tween-80作為乳化劑，促進油相包裹水相生成微滴。
[0016]本方法中渦旋攪拌有利于生成大小均勻、穩定的微滴。
【附圖說明】
[0017]圖1為利用本方法進行實驗的微滴生成結果圖一。
[0018]圖2為利用本方法進行實驗的微滴生成結果圖二。
[0019]圖3為利用本方法進行實驗的微滴生成結果圖三。
【具體實施方式】
[0020]PCR油相的制備:一次往試管中加入98%的丙三醇，0.5%的曲拉通X-100，0.5%的吐溫-80和I %的壬基苯基醚Igel C0520配制成總體積3ml的油相，充分攪拌混勻。
[0021]PCR水相的制備:在超凈臺中往試管中加入5.2 μ L，10 μπι的上游引物和下游引物和PCRmix 49.4 μ L,然后將試管轉移到PCR模板加入區加1.66fmol的模板，在超凈臺中滴加雙蒸水補足至260ul,充分混勾。
[0022]微滴的制備:分別取200 μ LPCR油相和100 μ LPCR水相，將100 μ LPCR水相快速加入到200 μ LPCR油相中，充分混勻并渦旋5min，反應10_15min，使油水反應體系充分乳化。
[0023]PCR反應:將上述充分乳化的油水體系分裝成沒管50 μ L設定PCR反應條件:95°C預變性5min，2個循環，95°C變性30s，56°C復性40s，72°C延伸30s，其中變性，復性和延伸共40個循環，72°C延伸5min 2個循環。
[0024]取出反應后的PCR溶液，如果出現微弱的分層現象則渦旋數秒。實驗結果如圖1-3所示。
[0025]所述水相由5.2 yL上游引物、5.2 yL下游引物、1.66fmolPCR模板、49.4 yL的PCRmix均勾混合，補雙蒸水至260 μ L。
【主權項】
1.一種可用于微滴數字PCR的微滴制備方法，其特征在于:該方法包括如下步驟， SI配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix,以及雙蒸水；將上述藥品以此均勻混合，作為反應水相備用，上述構成的配合比例關系為0.8-1:0.8-1:0.1-0.2:10-15:35-40 ;將上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix依次均勻混合，滴加雙蒸水后將溶液體系作為反應水相備用； S2 配制 PCR 油相，將 95 % -98 % 的丙三醇、0.1 % -0.5 % 的 Trit1n X-100、0.1% -0.5%的Tween-80、0.5% -1%的壬基苯基醚IgelC0520依次均勻混合，獲得的溶液作為反應油相備用； S3取I體積水相PCR加到2體積的PCR油相中，渦旋攪拌并反應，得到油包水微滴。
2.根據權利要求1所述的一種可用于微滴數字PCR的微滴制備方法，其特征在于:所述油包水微滴的粒徑10-100微米。
3.根據權利要求1所述的一種可用于微滴數字PCR的微滴制備方法，其特征在于:所述油相體系中丙三醇、Trit1n X-100、Tween-80、壬基苯基醚IgelC0520的配比為95-98:0.1-0.5:0.1-0.5:0.5-1 ο
4.根據權利要求1所述的一種可用于微滴數字PCR的微滴制備方法，其特征在于:所述水相一次性加入油相，并且渦旋攪拌。
5.根據權利要求1所述的一種可用于微滴數字PCR的微滴制備方法，其特征在于:所述水相和油相的體積比為1:2。
6.根據權利要求1所述的一種可用于微滴數字PCR的微滴制備方法，其特征在于:渦旋攪拌的時間為4-6min，反應時間為14_16min。
7.根據權利要求1所述的一種可用于微滴數字PCR的微滴制備方法，其特征在于:該方法包括如下步驟， PCR油相的制備:一次往試管中加入98%的丙三醇，0.5%的曲拉通X-100，0.5%的吐溫-80和I %的壬基苯基醚Igel C0520配制成總體積3ml的油相，充分攪拌混勻； PCR水相的制備:在超凈臺中往試管中加入5.2 μ L，10 μπι的上游引物和下游引物和PCRmix 49.4 μ L，然后將試管轉移到PCR模板加入區加1.66fmol的模板，在超凈臺中滴加雙蒸水補足至260ul，充分混勻； 微滴的制備:分別取200 μ LPCR油相和100 μ LPCR水相，將100 μ LPCR水相快速加入到.200 μ LPCR油相中，充分混勻并渦旋5min，反應10_15min，使油水反應體系充分乳化； PCR反應:將上述充分乳化的油水體系分裝成沒管50 yL設定PCR反應條件:95°C預變性5min，2個循環，95°C變性30s，56°C復性40s，72°C延伸30s，其中變性，復性和延伸共40個循環，72°C延伸5min 2個循環； 取出反應后的PCR溶液，如果出現微弱的分層現象則渦旋數秒； 所述水相由5.2 μ L上游引物、5.2 μ L下游引物、1.66fmolPCR模板、49.4 μ L的PCRmix均勾混合，補雙蒸水至260 μ Lo
【專利摘要】一種可用于微滴數字PCR的微滴制備方法，配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix、以及雙蒸水；將上述藥品以此均勻混合，作為反應水相備用；將上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix依次均勻混合，滴加雙蒸水后將溶液體系作為反應水相備用；配制PCR油相，將丙三醇、Trition X-100、Tween-80、壬基苯基醚IgelCO520依次均勻混合；取1體積水相PCR加到2體積的PCR油相中，渦旋攪拌并反應，得到油包水微滴；本發明提供的制備方法，可便捷地配制具有顆粒均勻、熱力學性能穩定的油包水反應微滴，簡便了微滴數字PCR實驗的操作。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104846100
【申請號】CN201510267209
【發明人】馮繼宏, 童石淵, 於然, 白樺娟
【申請人】北京工業大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月24日