一種提高人參根中人參皂苷Rg1含量的方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，涉及改良植物性狀，具體是通過發根農桿菌A4介 導的BbRha基因在人參發根中表達，利用其表達的酶將部分人參皂苷Re轉化成Rgl，進而增 加人參皂苷Rgl在人參根中的含量。本發明利用異源過表達BbRha基因以促進人參根中含 有鼠李糖殘基的人參皂苷Re水解，并轉化為人參皂苷Rgl，提高人參中人參皂苷Rgl的含 量，該發明利用BbRha基因增加人參皂苷Rgl產量方面有著重要的應用價值。
【背景技術】
[0002] 人參（P.ginsengC.A.Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物，是最著名的中草 藥之一。人參中含有多種藥用成分，其中人參皂苷是人參最主要的活性成分。目前已從人 參根中分離出1〇〇余種人參皂苷，現代醫學研宄證明各皂苷單體具有重要的藥用價值，且 已廣泛應用于臨床。人參皂苷是由極性極低的苷元與極性較高的糖基以糖苷鍵連接而成的 配糖體。由于苷元和糖基的種類、糖基的數量和糖基連接的碳位的不同，形成不同種類的人 參皂苷，其活性亦差別很大。其中一些具有抗腫瘤、抗衰老、抑制細胞凋亡和增強免疫力等 活性強的皂苷如Rgl的含量相對較低。
[0003] 研宄表明，與人參皂苷Rgl結構類似的人參皂苷Re能減少乙酰膽堿引起的豚鼠離 體子宮的收縮，對大鼠有減慢心率和雙相性血壓（先升后降）作用，對貓的行為和腦電圖顯 示中等程度的抑制作用。
[0004] 人參皂苷Rgl是Re在C-6上連接一個鼠李糖殘基的產物，研宄發現其具有廣泛的 藥理活性。人參皂苷Rgl在保護神經方面有著最為顯著的作用，尤其是治療帕金森氏癥的 潛在藥物。研宄表明，Rgl具有調節和保護神經細胞、保護大腦因缺血受到的損傷、促進海 馬體細胞的增殖、降低神經元死亡率等作用。同時也發現Rgl在心血管系統方面具有較高 的治療效果，例如Rgl可以治療中風引起的腦缺血、促進血管生長和保護心肌細胞的作用。 最近研宄表明Rgl具有類雌激素的作用，可激活促分裂原活化蛋白激酶途徑，還可以是糖 皮質激素受體的功能配體。Rgl還具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗衰老、抗疲勞、降血糖、提高免 疫活性和增強記憶力等作用。與人參皂苷Re相比，Rgl更具有獨特的藥理活性。

【發明內容】

[0005] 本發明旨在提供一種能夠采用基因工程技術提高人參根中人參皂苷Rgl含量的 方法，為今后利用轉基因人參植物選擇性提高人參皂苷Rgl的產量奠定基礎。
[0006] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0007] -種提高人參根中人參皂苷Rgl含量的方法，利用雙歧桿菌中a -L-鼠李糖苷酶 基因提高人參皂苷Rgl含量。
[0008] 雙歧桿菌，即BifidobacteriumbreveATCC15700 ;a-L-鼠李糖苷酶 (a-L-rhamnosidase)基因，即BbRha基因，GenBanknumber,CP006715. 1〇
[0009] 所述的BbRha基因利用RT-PCR技術克隆與鑒定。
[0010] 所述的BbRha基因利用發根農桿菌A4介導法轉入人參根，獲得過表達BbRha基因 的人參發根。
[0011] 所述的發根農桿菌A4介導法中，所采用的植物表達載體優選載體PBI121，將 BbRha基因克隆到空載體pBI121中，獲得重組載體pBI121-BbRha，然后采用凍融法轉化制 備成含BbRha基因的重組菌。
[0012] 所述的BbRha基因利用發根農桿菌A4介導法轉入人參根后，還包括卡那霉素篩 選、PCR和qRT-PCR檢測。
[0013] 所述的提高人參根中人參皂苷Rgl含量的方法在其它含人參皂苷Re的植物中的 應用。
[0014] 所述的提高人參根中人參皂苷Rgl含量的方法在生產人參皂苷Rgl單體中的應 用。
[0015] 本發明的有益效果在于：
[0016] 本發明利用現有的植物基因工程技術，根據已報道的基因序列設計引物，采用PCR 技術等方法克隆與鑒定人參皂苷Re生物轉化生產Rgl的基因序列，并通過發根農桿菌介導 法將基因轉入人參根，經過卡那霉素篩選、PCR和qRT-PCR檢測后獲得異源過表達BbRha基 因的人參發根。
[0017] 經體外酶活力測定鑒定，結果證明異源過表達BbRha基因的人參發根所產生的 BbRha蛋白具有水解末端為a-L-鼠李糖殘基的a-1，2及a-1，6糖苷鍵，并對人參皂苷 Re的C-6位a-1，2鼠李糖殘基具有水解能力。轉BbRha基因的人參發根中人參皂苷Re含 量明顯下降，人參皂苷Rgl含量明顯增加，證明人參皂苷Re部分轉化為人參皂苷Rgl。
[0018]經實驗證明，本發明的方法能夠將人參皂苷Re部分轉化為Rgl，進而提高人參皂 苷Rgl在人參發根中的含量，并且BbRha基因表達蛋白對人參皂苷Re的轉化選擇性較高， 因而本發明的方法能夠選擇性提高人參發根中人參皂苷Rgl含量。
[0019] 本發明的方法不僅能夠用于改良人參，還同樣適用于其它含人參皂苷Re的植物， 獲得人參皂苷Rgl含量高的優良植物品種，以生產人參皂苷Rgl單體。
【附圖說明】
[0020] 圖1是本發明通過PCR擴增的BbRha基因電泳結果；圖中，1表示PCR擴增產物，M 表不Marker;
[0021] 圖2是轉基因人參發根中BbRha、RolB、RolC和0-Actin基因RT-PCR檢測電泳 結果；圖中Control為對照，即轉pBI121空載體篩選得到的人參發根；T8、T13和T22為轉 pBI121-BbRha篩選得到的轉基因人參發根；
[0022] 圖3是轉基因人參發根中BbRha基因qRT-PCR檢測結果；圖中Control為對照，即 轉PBI121空載體篩選得到的人參發根；T8、T13和T22為轉pBI121-BbRha篩選得到的轉基 因人參發根；
[0023] 圖4是獲得的轉基因人參發根；圖中Control為轉pBI121空載體篩選得到的人參 發根；T8、T13和T22為轉pBI121-BbRha篩選得到的轉基因人參發根；
[0024] 圖5是轉基因人參發根培養30d后a-L-鼠李糖苷酶活性測定結果 (*P〈0. 05, #P〈0. 01);圖中Control為轉pBI121空載體篩選得到的對照人參發根；T8、T13 和T22為轉pBI121-BbRha篩選得到的轉基因人參發根；
[0025] 圖6是異源表達BbRha基因的人參發根中人參皂苷Rgl的含量測定結果；圖中 Control為對照，即轉空載體pBI121人發根中人參皂苷Rgl經HPLC測定后的含量，T8、T13 和T22分別為轉BbRha基因的人發根中人參皂苷Rgl經HPLC測定后的含量，結果顯示異源 表達BbRha基因的人參發根中，與對照相比，人參中皂苷Rgl含量明顯上升；
[0026] 圖7是異源表達BbRha基因的人參發根中人參皂苷Re的含量測定結果；圖中 Control為對照，即轉空載體pBI121人發根中人參皂苷Re經HPLC測定后的含量，T8、T13 和T22分別為轉BbRha基因的人發根中人參皂苷Re經HPLC測定后的含量，結果顯示異源 表達BbRha基因的人參發根中，與對照相比，人參中皂苷Re含量明顯下降；
[0027] 圖8是BbRha基因表達蛋白轉化人參皂苷Re為Rgl的分子機制示意圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明，但本發明并不限于此。
[0029] 實施例1
[0030]BbRha基因的獲得
[0031] 1、雙歧桿菌培養及DNA提取
[0032] ①以MRS液體培養基37°C厭養培養2-3d;
[0033] ②5000rpm離心菌液，取50mg雙歧桿菌菌體，在菌體中加入0. 5mLTE緩沖液， 0?lmL10mg/mL溶菌酶，40°C放置 1h;
[0034] @加入質量分數為10%十二烷基磺酸鈉（303)0.11^充分混勻后40°0放置111;
[0035] ④6000rpm離心5min，吸取上清液0. 5mL，加人上清液1/6體積的KAc，冰水浴 15min，12000rpm離心 10min;
[0036] ⑤取上清液，在上清液中加入上清液1/10體積的3mol/L的NaAc及上清液2倍體 積的預冷無水乙醇，冰水浴30min;
[0037] ⑥12000rpm離心10min，將上清液移至一新離心管，用冷乙醇洗滌沉淀，待乙醇風 干后加入50-100yLddH20(雙蒸水，即經過2次蒸餾而得的水）溶解備用。
[0038] 2、PCR擴增
[0039] (1)引物設計與合成
[0040] 根據Genbank序列號為CP006715. 1的序列信息，利用PrimerPremier5. 0軟件 對基因序列設計引物如下：
[0041] F：5'-CGCGGATCCATGCTCGATGATAGTGAACTGC-3r；(SEQIDNO. 1)
[0042]R：5'-CGAGCTCGTCATACGGACCTCATTTCAATCAC-3r。（SEQIDNO. 2)
[0043] 劃線部分分別為BamHI和SacI酶切位點，引物由長沙博尚生物有限公司合成。
[0044] (2)PCR擴增
[0045] 以雙歧桿菌DNA為模板，用引物PI、P2進行PCR擴增。
[0046]反應體系為：10XPCR緩沖液 2. 5yL、MgCl2(25mmol/L) 1. 5yL、dNTP(2. 5mmol/ L) 4yL、PI(20ymol/L) 1yL、P2 (20ymol/L) 1yL、DNA0? 5yL、ddH20 14yL和TaqDNA polymerase0.5yL〇
[0047]反應條件為：94°C預變性lOmin;94°C變性 30s、58°C退火 2min、72°C延伸 2min，35 個循環；72°C延伸lOmin。采用質量分數為1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。圖1為PCR擴增的BbRha基因電泳結果，圖中顯示得到約2300bp的片段，與預期推測的2328bp大 小一致。
[0048] (3)BbRha基因擴增片段膠回收、連接、測序及分析
[0049] PCR產物經質量分數為1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產物膠回收后BamH I和SacI雙酶切，連接至pUC18載體上，并轉化大腸桿菌DH5a。經藍白篩選和酶切初步鑒 定正確后，將重組質粒pUC18-BbRha送長沙博尚公司測序。測序結果利用NCBI中的Blast 工具與GenBank的dbEST數據庫進行同源性比對，結果表明得到的基因為BbRha基因片段。
[0050] 實施例2
[0051] 表達載體的構建及轉化
[0052] 1、植物過表達載體的構建
[0053] (1)分別用BamHI和SacI雙酶切pBI121和重組質粒pUC18-BbRha，回收pBI121 載體和BbRha基因片段。將兩片段連接并轉化DH5a，篩選出重組子，重組質粒命名為 pBI121-BbRha〇
[0054] (2)發根農桿菌感受態細胞的制備
[0055] ①在YEB平板上劃線培養發根農桿菌（A.rhizogenes)A4,28°C暗培養2d ;
[0056] ②挑取單菌落接種到YEB液體培養基中，28°C振蕩培養2d;
[0057] ③將培養活化的發根農桿菌按1 :50的體積比稀釋加入YEB液體培養基中，28°C振 蕩培養至0D600約為0. 4-0. 6,冰浴30min;
[0058] ④于 4°C，5000rpm離心lOmin，棄上清液，用 10mL0? 15mmol/LNaCl重懸菌體；
[0059] ⑤于 4°C，5000rpm離心 10min，棄上清液，用 2mL20mmol/LCaCl2重懸菌體；
[0060] ⑥每管200yL分裝，液氮速凍，-70 °C保存。
[0061] (3)發根農桿菌感受態細胞的轉化
[0062] ①將發根農桿菌感受態細胞置于冰上，緩慢解凍；
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