用于發酵含co的氣態底物的方法
【專利說明】
[0001] 與相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求均于2012年5月22日提交的美國臨時申請號61/650, 098、 61/650, 093、61/650, 077和61/650, 084的權益，所有上述臨時申請以其整體通過參考并入 本文。
技術領域
[0003] 本發明提供了一種用于發酵含C0的氣態底物（substrate)的方法。更具體來說， 使細菌在含C0的氣態底物存在下形成芽孢然后萌發，以提供接種物。得到的接種物有效地 為發酵提供了具有1或更高的比STY的乙醇生產率。
【背景技術】
[0004] 產乙酸微生物可以通過氣態底物的發酵從一氧化碳（C0)生產乙醇。使用來自于 梭狀芽胞桿菌屬（Clostridium)的厭氧微生物的發酵產生乙醇和其他有用產物。例如，美 國專利號 5, 173, 429 描述了楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)ATCC 號 49587,這種厭 氧微生物從合成氣體生產乙醇和乙酸鹽。美國專利號5, 807, 722描述了一種使用楊氏梭菌 (Clostridium ljungdahlii)ATCC號55380將廢氣轉變成有機酸和醇類的方法和裝置。美 國專利號 6, 136, 577 描述了一種使用楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)ATCC 號 55988 和55989將廢氣轉變成乙醇的方法和裝置。
[0005] 許多產乙酸微生物不太適合工業規模的生物過程，因此沒有顯示出用于此目的的 商業可行性。這樣的微生物具有緩慢的倍增時間和低的總生產率。此外，許多用于基因操 作的技術（敲除、通過整合或游離體質粒繁殖的轉入基因的過表達）低效、耗時、費力或不 存在。
[0006] 可以生長產乙酸微生物以從一氧化碳生產乙醇。所述生長過程可能包括將產乙酸 細菌在隨時間增加的量的C0上進行培養。對于更快地開發微生物以及使用它們利用合成 氣或其他氣態碳源生產所需化學品和燃料的方法，仍存在需求。
[0007] 發明概述
[0008] 一種用于發酵含一氧化碳（C0)的氣態底物的方法，包括供應能夠使用所述含C0 的氣態底物作為唯一碳源和能源生長的細菌細胞的接種物。所述方法包括供應所述氣態底 物以維持至少約0. 25mmol/g細胞的比C0攝入率（specific CO uptake)，并供應營養培養 基。在一種情況下，所述細菌細胞的接種物通過包括在含C0的氣態底物存在下形成芽孢然 后萌發的過程來生產。所述方法有效地提供了約lg乙醇AL ?天?克細胞）或更高的比 STY〇
[0009] 附圖簡述
[0010] 所述方法的幾種情況的上述和其他方面、特點和優點，從下面的附圖將變得更加 明顯。
[0011] 圖1示出了在甲醇上培養并降低pH后，食甲基丁酸桿菌（Butyribacterium methylotrophicum)通過芽孢形成和萌發在合成氣上的生長。
[0012] 圖2示出了在酵母提取物、甲醇上培養并酸化后，食甲基丁酸桿菌 (Butyribacterium methylotrophicum)通過芽孢形成和萌發在合成氣上的生長。
[0013] 圖3示出了在酵母提取物上培養并酸化后，食甲基丁酸桿菌（Butyribacterium methylotrophicum)合成氣上的生長。
[0014] 圖4不出了在預先將食甲基丁酸桿菌（Butyribacterium methylotrophicum)在 合成氣上生長后，食甲基丁酸桿菌（Butyribacterium methylotrophicum)在合成氣上的生 長。
[0015] 圖5示出了在酵母提取物上培養并降低pH后，產乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)在合成氣上的生長。
[0016] 圖6示出了在酵母提取物上培養并降低pH后，楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)在合成氣上的生長。
[0017] 圖7示出了發酵合成氣的楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)在果糖上的生 長。
[0018] 詳細描述
[0019] 下面的描述不應以限制性意義對待，而是僅僅出于描述示例性實施方式的一般性 原理的目的做出。本發明的范圍應該參考權利要求書確定。
[0020] 本文描述的方法有效地為發酵提供了高水平的乙醇生產率。就此而言，所述方法 有效地提供的比STY(用g乙醇AL ?天*g細胞）表示的比空間時間產率）為至少約1，在 另一種情況下約1至約10,在另一種情況下約2至約8,在另一種情況下約3至約7并且在 另一種情況下約4至約6。
[0021] 定義
[0022] 除非另有定義，否則在本公開的整個本說明書中使用的下列術語被定義如下，并 且可以包括下面規定的定義的單數或復數形式：
[0023] 修飾任何量的術語"約"是指所述量在真實世界條件下，例如在實驗室、中試工廠 或生產設施中遇到的變化性。例如，在混合物中使用的成分的量或測量值或數量，當用"約" 修飾時，包括在生產廠或實驗室中的實驗條件下的測量中通常使用的變化性和照管程度。 例如，產物的組分的量，當用"約"修飾時，包括在工廠或實驗室中的多次實驗中批次之間的 變化性，以及分析方法中固有的變化性。不論是否用"約"修飾，所述量包括那些量的等同 量。本文中陳述的并且用"約"修飾的任何數量，當所述量沒有被"約"修飾時，也可用于本 公開。
[0024] 術語"合成氣"或"合成氣體"是指為含有不同量的一氧化碳和氫氣的氣體混合物 命名的合成氣體。生產方法的實例包括天然氣或烴類的蒸汽重整以產生氫氣，煤的氣化，以 及在某些類型的廢物變能量的氣化設施中。所述名稱來自于它們在產生合成天然氣（SNG) 和用于生產氨或甲醇中用作中間體。合成氣是可燃的，并且通常被用作燃料源或作為生產 其他化學品的中間體。
[0025] 術語"發酵"、"發酵方法"或"發酵反應"等，打算涵蓋所述方法的生長階段和產物 生物合成階段兩者。在一種情況下，發酵是指C0向醇類的轉化。
[0026] 術語"細胞密度"是指每單位體積發酵液的微生物細胞的質量，例如克/升。
[0027] 術語"細胞回收利用"是指從發酵培養液分離微生物細胞，并將全部或一部分分離 到的微生物細胞返回到發酵罐。一般來說，使用過濾裝置來實現分離。
[0028] 產乙酸培養物
[0029] 在一種情況下，所述方法包括在可能包含第一底物的第一培養基中培養或繁殖 細菌。所述第一培養基可以為細菌提供適合的碳源和能源以及其他營養物，包括生長因 子。就此而言，第一培養基包括諸如維生素、微量元素和氨基酸的組分。第一培養基可以 包含碳源，其包括酵母提取物、糖類、醇、氨基酸、蛋白胨（peptone)、肽、蛋白質、脂肪酸、月旨 質及其混合物。例如，由培養物保藏中心例如ATCC提供的細菌，可能包括推薦的培養基， 其包含諸如蛋白胨、葡萄糖、果糖、酵母提取物、氨基酸、維生素和微量元素的組分。第一培 養基可以提供允許細胞密度快速增加的組分。就此而言，第一培養基可以具有約5. 7至約 7.0的pH。可以利用的第一培養基的一些實例包括ATCC培養基1754 (http：//www. atcc. org/Attachments/2940. odf)、ATCC培養基1136(含有0. 1%酵母提取物、50mM乙酸鈉和 100mM甲酉享，http: //www. atcc. org/Attachments/2408. pdf)、ATCC培養基1019 (http: // www.atcc. org/Attachments/3112. pdf)和ATCC培養基1016(//www.atcc. org/ Attachments/2299. pdf)〇
[0030] 在另一種情況下，所述第一培養基和底物有效地維持約0. 005g/L或更高、在另一 種情況下約〇. 〇2g/L或更高、在另一種情況下約0. 03g/L或更高、在另一種情況下約0. 04g/ L或更高、在另一種情況下約0. 05g/L或更高、在另一種情況下約0. lg/L或更高、在另一種 情況下約〇. 3g/l或更高、在另一種情況下約0. 5g/L或更高、在另一種情況下約0. 75g/L或 更高并且在另一種情況下約1. 〇g/L或更高的細胞密度。
[0031] 在一種情況下，所利用的微生物包括產乙酸細菌。有用的產乙酸細菌的實例包 括梭狀芽胞桿菌屬（Clostridium)的細菌，例如楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii) 菌株，包括在 WO 2000/68407、EP 117309、美國專利號 5, 173, 429、5, 593, 886 和 6,368,819、W0 1998/00558 以及 W0 2002/08438 中所描述的；產乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)菌株（德國 DSMZ 的 DSM 10061 和 DSM 19630)，包括在 W0 2007/117157 和 TO 2009/151342 中所描述的；以及拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)(Pll，ATCC BAA-622)和 Alkalibaculum bacchi(CPll，ATCC BAA-1772)，包括分別在美國專利 號7, 704, 723和"來自于生物質產生的合成氣體的生物燃料和生物產品"（Biofuels and Bioproducts from Biomass-Generated Synthesis Gas， Hasan Atiyeh, 在 OklahomaEPSCoR年度國家會議上的報告，2010年4月29日）中所描述的；以及在美國 專利申請號2007/0276447中描述的食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans) (ATCC PTA-7827)。其他適合的微生物包括穆爾氏菌屬（Moorella)的微生物和一氧化碳嗜 熱菌屬（Carboxydothermus)的微生物，所述穆爾氏菌屬的微生物包括穆爾氏菌Moorella SP.HUC22-1。每個這些參考文獻通過參考并入本文。可以使用兩種或更多種微生物的混合 培養物。
[0032]有用的細菌的一些實例包括凱伍產醋菌（Acetogenium kivui)、潮濕厭氧醋菌 (Acetoanaerobium noterae)、伍氏醋酸桿菌（Acetobacterium woodii)、Alkalibaculum bacchi CPI 1 (ATCC BAA-1772)、延長布勞特氏菌（Blautia producta)、食甲基丁酸 桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)、 Caldanaerobacter subterraneous、 Caldanaerobacter subterraneous pacificus、生氫一氧化碳嗜熱菌（Carboxydothermus hydrogenoformans)、醋酸梭菌（Clostridium aceticum)、丙酮丁 醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)P262 (德國 DSMZ 的 DSM 19630)、產乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)(德國 DSMZ 的DSM 19630)、產乙醇梭 菌（Clostridium autoethanogenum)(德國 DSMZ 的 DSM 10061)、產乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)(德國 DSMZ 的 DSM23693)、產乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum) (德國 DSMZ 的 DSM 24138)、食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans)P7(ATCC PTA-7827)、Clostridium coskatii(ATCC PTA-10522)、德雷克氏梭菌（Clostridium drakei)、楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)PETC(AT(X49587)、楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)ERI2(ATCC 55380)、楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)C_01(ATCC 55988)、楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii) 0-52 (ATCC 55889)、大梭菌（Clostridium magnum)、巴氏梭菌（Clostridiu