D-阿洛糖的生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及由來自屬于鏈霉菌屬（Streptomyces)的微生物的序列號1或序列號2 所記載的氨基酸序列構成的蛋白質的新型用途，即將D-阿洛酮糖異構化為D-阿洛糖的酶 的用途。
[0002] 本發明明確了屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生物生產的上述酶所具有的催 化糖異構化反應的催化劑功能，涉及利用該新型催化劑功能生產D-阿洛糖的技術。
【背景技術】
[0003]單糖類根據還原基（羰基）的狀態可以大致分為醛糖（具有醛基作為羰基的糖）、 酮糖（具有酮基作為羰基的糖）、糖醇（別名：多元醇，不具有羰基的糖）。單糖類中具有被 稱為"稀少糖"的糖。稀少糖根據國際稀少糖學會的定義被定為自然界只稀少地存在的糖， 根據其種類，多數有機化學合成方法中的收率也少。因此，現狀是尋求包括阿洛糖的己醛糖 (醛糖）稀少糖的有效的制造方法的開發和其特異的性質。
[0004] 已知稀少糖具有生理活性。例如，公開了以D-阿洛糖的衍生物為有效成分的抗腫 瘤劑（專利文獻1)，利用糖類對活性氧的性質的情況，例如，已知有含有具有抑制活性氧的 性質的多糖類的活性氧產生抑制劑（專利文獻2)。
[0005] 阿洛酮糖是具有酮基作為還原基的六碳糖，近年來，由于表異構酶的出現而成為 比較容易得到的糖。暗示了D-阿洛酮糖能夠有效地利用為甜味料、發酵用碳源、試劑、化妝 品?醫藥品的原料?中間體等。阿洛酮糖的作為試劑?醫藥品等的中間原料的應用例，例 如，報告有以D-阿洛酮糖作為原料的乙內酰脲衍生物的合成例（非專利文獻1)。
[0006]D-阿洛糖可以由D-阿洛酮糖制造。例如，與利用了作為能夠由D-阿洛酮糖生產 D-阿洛糖的酶的異構酶的D-阿洛糖的制造相關的專利文獻中，例如有一種精制稀少糖的 大量生產方法，其特征在于，通過對異構化進行催化的酶的作用由基質稀少糖轉換為目標 稀少糖，通過模擬移動床將得到的原液連續地色譜分離為目標稀少糖組分（專利文獻3)。 或者，提出了使來自施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)(IPODFERMBP-08593)的具有 L_鼠李糖異構酶活性的蛋白質作用異構化為D-阿洛糖的D-阿洛糖的生產方法（專利文獻 4)〇
[0007] 另外，提出了使D-木糖?異構酶作用于含有D-阿洛酮糖和/或L-阿洛酮糖的溶 液，由D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖和D-阿卓糖，由L-阿洛酮糖生成L-阿卓糖，采集選自這 些D-阿洛糖、D-阿卓糖以及L-阿卓糖中的1種或2種以上的己醛糖的己醛糖的制造方法 (專利文獻5)。
[0008] 現有技術文獻
[0009] 專利文獻
[0010] 專利文獻1:日本特公昭59-40400號
[0011] 專利文獻2:日本特開平07-285871號公報
[0012] 專利文獻3 :日本特開號公報
[0013] 專利文獻4:日本特開號公報
[0014] 專利文獻5:日本特開2002-17392號公報
[0015] 專利文獻6 :國際公開W號
[0016] 專利文獻7:美國專利5, 620, 960(1999)
[0017] 專利文獻8:日本特開號公報
[0018] 非專利文獻
[0019]非專利文獻 1 :Tetrahedron，47，No. 12/13，p2113(1991)
[0020] 非專利文獻 2 :J.Bacteriol.，73:410-414 (1956)
[0021] 非專利文獻 3 :J.BiosciBioeng.，96:89-91 (2003)
[0022] 非專利文獻 4:Davisetal.，BASICMETHODSINMOLECULARBIOLOGY, 1986
[0023]非專利文獻 5:MethodsCarbohydr.Chem.，1:102-104 (1962)
[0024]非專利文獻 6 :Carbohydr.Res.，24:192-197 (1972)
[0025]非專利文獻 7 :J.FermentBioeng.，8:539_541 (l"8)
[0026]非專利文獻 8 :J.Mol.Biol. ,300:917-933 (2000)

【發明內容】

[0027] 發明所要解決的技術問題
[0028] -直以來雖然開發了由各種微生物制造D-阿洛糖的技術，但是由于該微生物的 安全性方面有問題，所以難以在D-阿洛糖的生產中實用化。因此，一直以來尋求使用來自 安全性沒有問題的微生物的酶生產稀少糖。
[0029] 關于稀少糖的制造，例如，已知有通過利用來自菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)的D-己酮糖3-表異構酶可以由D-果糖制造D-阿洛酮糖。然而，由于菊苣假單 胞菌是植物病原性微生物，因此，不能說其適合利用于食品用途。也提出了通過屬于根瘤菌 屬的微生物來制造D-阿洛酮糖（專利文獻6)，但是屬于根瘤菌屬的微生物也是植物病原性 微生物，作為用于食品用途的菌不優選。另外，這些技術都是生產D-阿洛酮糖的技術，不是 生產D-阿洛糖的而技術。
[0030] 為了解決與這樣的現有技術的安全性相關的問題，本發明的目的在于從能夠推測 出確認能用于制造食品時的現有的添加物名單收載品種目錄中所收載的菌種且幾乎沒有 毒性的菌種中，取得以高收率對由D-阿洛酮糖異構化為D-阿洛糖進行催化的異構酶，并提 供使用了該酶的D-阿洛糖的制造方法。
[0031] 另外，本發明提供一種通過由可以作為現有的添加物對食品的制造沒有問題地使 用的可能性高的放線菌得到的新型的酶來制造D-阿洛糖的方法。
[0032] 解決技術問題的技術手段
[0033] 本發明者們尋求沒有作為這樣的現有技術的技術問題的安全性相關的擔憂的生 產D-阿洛糖的微生物、即微生物生產的該酶，進行了重復研宄，由此，完成了本發明。即，本 發明是基于從土壤中分離放線菌制作庫，從其中發現了具有從D-阿洛酮糖轉換為D-阿洛 糖的作用的酶而成的。由于放線菌可以作為現有的添加物酶的起源微生物食品制造上沒有 問題地使用的可能性高，因此，由放線菌得到的異構酶能夠作為非常有用的D-阿洛糖的大 量生產的手段。
[0034] 即，本發明以以下的（1)~（3)中記載的具有活性的蛋白質為要點。
[0035] (1) -種蛋白質，其中，具有如下的活性：識別醛糖C1的CH0基團和C2的0H基團 并進行反應，將C1的CH0基團轉變為0H基團，將C2的0H基團轉變為C0基團；或者識別酮 糖C1的0H基團和C2的C0基團并進行反應，將C1的0H基團轉變為CH0基團，將C2的C0 基團轉變為0H基團；
[0036] 并且，所述蛋白質是下述（a)至（c)中任一記載的蛋白質：
[0037] (a)由序列號1或序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；
[0038] (b)由序列號1或序列號2所示的氨基酸序列中，1個或多個氨基酸殘基被置換、 添加、插入或缺失而成的氨基酸序列構成的蛋白質；
[0039] (c)由與序列號1或序列號2所示的氨基酸序列具有60%以上的同源性的氨基酸 序列構成的蛋白質。
[0040] (2)如上述⑴所述的蛋白質，其中，將酮糖的D-阿洛酮糖異構化為醛糖的D-阿 洛糖。
[0041] (3)如上述⑴或⑵所述的蛋白質，其中，所述蛋白質是由以下⑷~（f)的物 理化學性質特定的，
[0042] (d)作用pH和最適pH，
[0043] 作用pH為 6.0 ~11.0,最適pH為 9.0 ;
[0044] (e)作用溫度和最適溫度，
[0045] 作用溫度為10~80°C，最適溫度為60°C;
[0046] (f)對于L-鼠李糖、D-木糖、D-核糖、D-阿洛糖、D-葡萄糖以及L-阿拉伯糖有反 應性。
[0047] 另外，本發明的要點還在于⑷所記載的DNA、（5)所記載的重組載體、（6)所記載 的宿主細胞、以及（7)所記載的重組蛋白質的制造方法。
[0048] (4) 一種來自鏈霉菌(Streptomycessp. ) 710 (保藏號：NITEBP-01423)或鏈霉菌 (Streptomvcessp.) 720 (保藏號：NITEBP-01424)的DNA，其中，編碼由序列號3或序列號 4所示的堿基序列或其互補序列、或者包含這些序列的一部分或全部的序列構成的權利要 求1或2所述的蛋白質。
[0049] (5) -種重組載體，其中，包含上述⑷所述的DNA。
[0050] (6) -種宿主細胞，其中，包含能夠表達上述（1)、⑵或⑶所述的蛋白質的表達 體系。
[0051] (7) -種重組蛋白質的制造方法，其特征在于，在培養基中培養上述（6)所述的包 含表達體系的宿主細胞，從得到的培養物中采取上述（1)、（2)或（3)所述的重組蛋白質。
[0052] 另外，本發明的要點還在于以下（8)至（12)的D-阿洛糖的生產方法。
[0053] (8) -種D-阿洛糖的生產方法，其特征在于，使上述（1)、⑵或⑶所述的蛋白 質作用于D-阿洛酮糖，將D-阿洛酮糖異構化為D-阿洛糖。
[0054] (9)如上述⑶所述的D-阿洛糖的生產方法，其中，D-阿洛酮糖是將D-果糖表異 構化來生產的。
[0055] (10)如上述⑶所述的D-阿洛糖的生產方法，其中，D-阿洛酮糖是將D-葡萄糖 異構化轉變為D-果糖，將該D-果糖表異構化來生產的。
[0056] (11)如上述⑶所述的D-阿洛糖的生產方法，其中，D-阿洛酮糖是由未利用資源 得到D-葡萄糖，將該D-葡萄糖異構化轉變為D-果糖，將該D-果糖表異構化來生產的。
[0057] (12)如上述⑶~（11)中任一項所述的D-阿洛糖的生產方法，其中，作為目標的 D-阿洛糖為D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合物。
[0058] 發明的效果
[0059] 根據本發明，即通過使用來自屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生物的酶蛋白 質，從而能夠識別醛糖C1的CH0基團和C2的0H基團并進行反應，將C1的CH0基團轉變為 0H基團，將C2的0H基團轉變為C0基團；或者識別酮糖的C1的0H基團和C2的C0基團并 進行反應，將C1的0H基團轉變為CH0基團，將C2的C0基團轉變為0H基團，優選能夠由 D-阿洛酮糖生產D-阿洛糖。本發明可以提供由來自屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生 物的序列號1或序列號2所記載的氨基酸序列構成的酶，所述酶識別醛糖C1的CH0基團和 C2的0H基團并進行反應，將C1的CH0基團轉變為0H基團，將C2的0H基團轉變為C0基 團；或者識別酮糖的C1的0H基團和C2的C0基團并進行反應，將C1的0H基團轉變為CH0 基團，將C2的C0基團轉變為0H基團，優選將D-阿洛酮糖異構化為D-阿洛糖，另外，通過 使用所述酶可以生產D-阿洛糖。
[0060] 根據本發明，能夠使用菌體培養物的安全性非常高的菌是很大的技術進步，將 D-阿洛酮糖異構化生產D-阿洛糖的酶及其制造方法的確立不僅在制糖產業，在與其相關 的食品、化妝品、醫藥品產業中的工業意義也極大。另外，本發明能夠以最廉價可以大量取 得的D-葡萄糖、或者果糖為原料經由D-阿洛酮糖制造D-阿洛糖。
【附圖說明】
[0061] 圖1是表示實施例1的重組型異構酶的