巖藻聚糖硫酸酯及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，具體地說，涉及一種巖藻聚糖硫酸酯的制備方法以及 由該方法所獲得的產物。 技術背景
[0002] 巖藻聚糖硫酸酯（Fucoidan)是一類主要由巖藻糖及硫酸酯基團組成的多糖類物 質，廣泛存在于多種褐藻及一些海洋無脊椎動物(如海參、海膽等）中。1913年，Kylin從褐 藻掌狀海帶（Laminariadigitata)中首次提取得到巖藻聚糖硫酸酯。大量研究證實巖藻 聚糖硫酸酯具有抗凝血、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫機能等多種生物學活性。
[0003] 盡管關于巖藻聚糖硫酸酯的結構研究較多，由于其結構缺乏規律且常常帶有分支 結構，絕大多數巖藻聚糖硫酸酯的精細結構仍未被闡明。巖藻聚糖硫酸酯的結構存在明顯 的種間差異，某些種類褐藻如墨角藻（Fucusvesiculosus)及海洋無脊椎動物，其含有的巖 藻聚糖硫酸酯結構較為簡單，基本上只包含巖藻糖及硫酸根。但是絕大多數的巖藻聚糖硫 酸酯結構復雜，還可能包含其他中性單糖如甘露糖、半乳糖、葡萄糖、木糖等，有些還含有糖 醛酸及乙酰基團。
[0004] 海洋無脊椎動物來源結構較為簡單，主要是由L-巖藻糖所構成的直鏈多糖， 從一種美國肉參中分離得到巖藻聚糖硫酸酯，經解析推測其結構為[―3Fuc(2S，4S) a1 - 3Fuc(2S)a1 - 3Fuc(2S)a1 - 3Fuca1 -]n的重復單元構成。
[0005]目前，對于來源于動物的巖藻聚糖硫酸酯類多糖的研究較少，常采用的提取方法 主要是蛋白酶水解法。蛋白酶水解法是提取動物多糖比較理想的方法，它在不改變多糖鏈 結構的前提下，以蛋白酶水解，對于多糖的釋放十分有效。為了使蛋白質充分水解，所用蛋 白水解酶多采用兩種以上酶制劑來加強水解效果。但酶解法提取多糖耗時長，且所得到的 多糖中蛋白殘留量較多。
[0006]提取的動物多糖常為混合物，如海參多糖則主要包括海參硫酸軟骨素和巖藻聚糖 硫酸酯，需對其進行分離純化。目前，常用的分離純化方法有乙醇分級、鹽分級、離子交換色 譜法及凝膠過濾色譜法等。乙醇分級分離及鹽分級分離可將巖藻聚糖硫酸酯與其他多糖粗 略分開，其成本低廉，易于操作，但得到的產物純度較低。離子交換色譜法及凝膠過濾色譜 法，純化效果好，獲得巖藻聚糖硫酸酯純度高，但是樹脂價格昂貴，操作繁瑣，處理規模小。
[0007]天然巖藻聚糖硫酸酯因其分子量較大，不易被人體吸收利用，因此，大多將其降解 為低聚巖藻聚糖硫酸酯，其具有粘度低、易吸收、生物利用率高等優點，表現出更好的生物 活性。常用的降解多糖方法包括物理法、化學法和酶解法。物理降解法，如超聲波法、輻射 降解法，該類方法節省能源和時間、簡化操作程序、減少有機溶劑使用、提高反應速率和顯 著降低化學反應產生的廢棄物對環境造成的危害等優點，但是突出的缺點是收率太低，生 產成本過高，不易實現工業化生產。酶解法，反應條件溫和，能耗低，而且酶催化具有高效性 和專一性，能選擇性地切斷糖苷鍵。酶降解多糖成本高，尚無專一性的降解酶，且篩選酶的 過程也是個比較復雜的問題。化學降解法，如氧化降解法，傳統的過氧化氫降解法過氧化氫 用量大，增加了降解產物分離純化的難度，反應所需降解溫度比較高，容易引起產品變色， 影響產品外觀。
[0008] 現有針對巖藻聚糖硫酸酯提取、分離純化、降解技術均存在不足，這在一定程度上 制約了巖藻聚糖硫酸酯的研究與利用。

【發明內容】

[0009] 本發明的一個目的是提供一種巖藻聚糖硫酸酯的制備方法，包括以下步驟：
[0010] (1)以干燥棘皮動物為原料，以堿解、酶解提取獲上清液；
[0011] (2)調節上清液pH值沉淀蛋白質，離心、鹽析、醇沉獲得粗多糖；
[0012] (3)經乙醇分級沉淀、超濾，獲得巖藻聚糖硫酸酯；
[0013] (4)采用元素周期表第四周期過渡金屬離子形成的催化劑催化的過氧化物降解或 經酸降解獲得低聚巖藻聚糖硫酸酯；
[0014] 其中，所述低聚巖藻聚糖硫酸酯的重均分子量為8-140kDa，其結構特征為至少包 括質量百分比為40%-60%的巖藻糖的20%-40%的硫酸酯基。
[0015] 進一步地，步驟1所述堿解的條件為：加入6-10倍體積量的0. 1~lmol/LNaOH或 K0H溶液，30°C~60°C下攪拌提取1~5小時；步驟1所述酶解的條件為：加入濃度0. 1~2% 的木瓜蛋白酶、胰酶或胃蛋白酶酶解；步驟2所述上清液pH值為2~4 ;鹽析條件為0. 5~ 2mol/L醋酸鉀或醋酸鈉；醇沉的乙醇質量濃度為40%~80% ;步驟3所述乙醇分級沉淀的乙 醇質量濃度為45%~80% ;步驟4所述元素周期表第四周期過渡金屬離子形成的催化劑為 選自Cu+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Cr2072-、Mn2+、Zn2+、Ni2+形成的無機鹽或有機鹽，或其組合，其 中，所述金屬離子優選Cu2+，在反應體系中，所述金屬離子的濃度范圍為lnmol/L~0.lmol/ L，優選的濃度范圍為10ymol/L~10mmol/L;步驟4所述過氧化物為選自過氧乙酸、過氧 化氫、過硫酸鈉，優選過氧化氫；步驟4所述酸降解為選自濃度0. 005~0.lmol/L的冰醋 酸、檸檬酸、鹽酸、硫酸；反應溫度為40~80°C;反應時間為30分鐘~8小時，反應結束時， 加入氫氧化鈉或氫氧化鉀中和而終止反應。
[0016] 本發明所述低聚巖藻聚糖硫酸酯還包括葡萄糖、半乳糖和氨基半乳糖，其與巖藻 糖的摩爾百分比為：（〇? 01~〇? 04) : (0~0? 03) : (0~0? 02) : 1。
[0017] 本發明的另一個目的是提供一種由上述方法制備而成的低聚巖藻聚糖硫酸酯及 其藥學上可接受的鹽，所述藥學上可接受的鹽為選自鈉鹽、鉀鹽和鈣鹽。
[0018] 本發明的又一個目的是提供本發明所述低聚巖藻聚糖硫酸酯在預防和/或治療 抗血栓藥物中的應用。
[0019] 本發明所述的棘皮動物來源包括梅花參、刺參、綠刺參、玉足海參、黑海參、黑乳海 參、糙海參、海星等。
[0020] 在本發明的方法中，元素周期表第四周期過渡金屬離子形成的催化劑催化的過氧 化物降解巖藻聚糖硫酸酯的過程中，過氧化物可以在反應體系中產生自由基，并通過自由 基鏈式反應裂解巖藻聚糖硫酸酯的糖苷鍵，進而形成所述低聚巖藻聚糖硫酸酯產物。在所 述巖藻聚糖硫酸酯的解聚反應過程中，過氧化物反應物可以在反應前一次性全部加入到反 應體系中，也可以采用持續或斷續性方式將過氧化物反應物逐步加入到反應體系中。本發 明優選將過氧化物反應物按照可控速率的方式持續加入到反應體系中。所述降解反應過程 的常規工藝參數為：pH7. 0~8. 0 ;溫度范圍為30°C~75°C;反應時間為30分鐘~8小時； 反應可以在常壓或加壓條件下進行。反應結束時，加入螯合劑使之與金屬離子催化劑螯合 而抑制催化反應速度，繼而通過冷卻、有機溶劑沉淀等技術手段終止反應。螯合劑包括但不 限于乙二胺四乙酸（EDTA)、二乙烯三胺五乙酸（DTPA)、3-丙二胺四乙酸（PDTA)、三乙酸基 氨（NTA)或它們的鹽。本發明方法優選乙二胺四乙酸二鈉或其水合物。有機溶劑優選乙醇。 [0021] 本發明的優點在于方法簡單，條件溫和，收率較高，制備得到的產品純度高，巖藻 糖及硫酸酯基含量高，且可獲得系列分子量的低聚巖藻聚糖硫酸酯。
[0022] 本發明所述低聚巖藻聚糖硫酸酯具有一定強度的抗凝血活性，因此可以用于不同 程度的血栓性疾病的預防和治療，例如血栓形成性心血管疾病、血栓性腦血管病，肺靜脈血 栓、周圍靜脈血栓、深靜脈血栓、周圍性動脈血栓等。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明并不局限于具體實施 例。以下實例施所使用的實驗材料、儀器和設備，除特別說明以外，均為普通市售。
[0024]【實施例1】巖藻聚糖硫酸酯的制備
[0025] 取干燥梅花參切片（厚度約1.5mm) 1kg，裝入反應罐（25L)中，加入8L0.5mol/L NaOH溶液，40°C下攪拌提取3小時。冷卻后，用6mo1/L鹽酸調pH值為6~7，加入7L木瓜蛋 白酶水溶液(含木瓜蛋白酶5§，8\10勺/^)，501：攪拌反應6小時，升溫至1001：保持101^11 滅酶。冷卻，離心去沉淀。所得上清液用6mol/L鹽酸調pH2. 5 (沉淀蛋白），4°C靜置4h，離 心去沉淀。上清液調至中性，加入醋酸鉀使其終濃度為lmol/L，并加入乙醇至60% (v/v)， 靜