一種用于誘導生產纖維素酶的糖混合液的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于誘導生產纖維素酶的糖混合液的制備方法及應用，屬于微生 物發酵技術領域。
【背景技術】
[0002] 纖維素和半纖維素是世界上最豐富的可再生能源，利用纖維素酶和半纖維素酶可 W將其水解為葡萄糖和木糖，通過生物法或者化學法進一步轉化為己醇、下醇、木糖醇和慷 酵等生物能源和生物基化學品，對于解決未來能源危機，維持社會的可持續發展具有重要 意義。
[0003] 絲狀真菌和分解纖維素的細菌能生成胞外纖維素酶，該賦予該生物水解纖維素 目-1,4糖巧鍵從而生成纖維寡糖或者葡萄糖的能力，該些酶給生物提供了利用纖維素來生 長的能力。
[0004] 里氏木霉如沁乃貓reesei)是目前發現的最有效的纖維素酶生產菌之一，而 且已經開發了里氏木霉纖維素酶的產品，該些產品廣泛應用于生物能源、洗涂劑和布料等 領域。此外，還已經開發了里氏木霉生產異源蛋白的能力。可操作的連接到里氏木霉可誘 導的啟動子后，編碼目標蛋白的基因可W被調節。其中，啟動子是迄今為止發現 的在里氏木霉中表達能力最強的啟動子，但是CM2啟動子為誘導型啟動子，使用何種誘導 物是能否實現基因大量表達的關鍵。而且里氏木霉中主要的分泌型纖維素酶基因均為誘導 型，比如<；?/7備人<；?化^、媒人6妨、6樹、乂7/7人^：網巧[]姑如等，其表達和生成均由誘導物所決 定，已經發現槐糖是其最強有力的液體誘導物，其誘導能力是纖維二糖的2500倍，是乳糖 的233倍，并且誘導能力高于纖維素（J. Bacteriol. 1962，83，400-408)。而葡萄糖是 該些纖維素酶基因表達的抑制物，但是有些里氏木霉突變體，比如Rut-C30已經部分解除 葡萄糖抑制，同時發現里氏木霉中CRE1蛋白為使葡萄糖抑制的主要蛋白，將其敲除或者突 變，有助于在葡萄糖培養基中使纖維素酶和半纖維素酶基因表達。
[0005] 纖維素酶的商業化生產最大的問題是給木霉提供合適的誘導物。目前普遍采用纖 維素類物質或者乳糖分批補料發酵來生產纖維素酶。但是利用該兩種誘導物來生產纖維素 酶均有一定的缺陷，利用纖維素類物質生產纖維素酶，會使液體培養基中固體物質含量過 高，導致發酵罐難于控制，過大的發酵罐轉速消耗能源，同時固體物質不易于流加培養，并 且該些物質通常需要一定的預處理之后才能使用；而乳糖在一些國家和地區價格昂貴，不 適用于大規模生產，該些因素導致纖維素酶生產成本過高。
[0006] 有研究者證實（Agric. Biol. Chem.，1987，51 巧)，2255-2化6)，甜菊糖巧利 用一定濃度的鹽酸在一定溫度下，賠育一定時間后，分離純化，利用活性炭層析可W制備純 度較高的槐糖，而槐糖是纖維素酶的最強力誘導物。但是該個步驟中槐糖的分離和純化即 耗時耗力，又增加了生產成本。另外，水解液中的葡萄糖沒有得到利用，所W本工作直接利 用葡萄糖和槐糖混合液進行誘導纖維素酶基因表達，葡萄糖可W作為微生物生長的碳源， 而槐糖可W作為誘導物，該種方法避免了純化槐糖的成本，簡化了誘導物的生產過程，具備 創新性。
[0007] 通過使用可溶性底物和誘導物巧日乳糖和槐糖)，可W克服與使用纖維素作為誘導 物相伴隨的一系列問題。槐糖是比纖維素更有效的誘導物，但是槐糖價格昂貴難W生產。因 此，在比固體纖維素更容易控制和處理的同時，槐糖仍然使生產纖維素酶的成本昂貴而難 W接受，因此用W工業化生產纖維素酶是不切實際的。顯然，仍然需要方便的可溶性底物、 并且低廉的在絲狀真菌巧日里氏木霉）中誘導纖維素酶的方法。另外，用廉價的誘導劑來調 節可誘導的啟動子表達內源基因或外源基因的能力具有巨大的商業價值。

【發明內容】

[0008] 本發明提供了一種用于誘導生產纖維素酶的糖混合液的制備及應用，W解決在纖 維素酶生產或者外源蛋白生產過程中利用高濃度纖維素導致的發酵難控制、能耗過大問題 等導致的成本過高問題。通過廉價的混合糖可溶性誘導物，高水平的生產纖維素酶或者來 自不同異源構建體的蛋白。
[0009] 本發明的技術方案是：一種用于誘導生產纖維素酶的糖混合液的制備方法包括下 述步驟： (1) 將含糖巧類物質配成濃度為5%-20% (重量/重量）水溶液，再加入無機酸或 者有機酸，使混合物的酸濃度為0.01 mol/1-l mol/L;所述含糖巧類物質為甜菊糖巧 (Stevioside)、萊鮑迪巧 A (Rebaudioside A)、萊鮑迪巧 B (Rebaudioside B)或者萊鮑迪 巧C (Rebaudioside C)或其混合物；所述無機酸為鹽酸、硫酸、次氯酸、硝酸或磯酸，所述有 機酸為甲酸、己酸、丙酸、馬來酸、蘋果酸或巧樣酸； (2) 在25-25(TC下賠育1 min-100 h，冷卻，過濾后液體為含有槐糖和葡萄糖的糖混合 液，其中酸濃度越高，可使用的反應溫度越低，當反應溫度達到22CTC W上時，不加入任何酸 來水解甜菊糖。
[0010] 一種用于誘導生產纖維素酶的糖混合液的應用包括W下步驟： (1) 斜面培養；包含可誘導啟動子的野生型細胞或包含纖維素酶啟動子的構建體在3% 麥芽浸粉固體培養基中在28 C下培養7 d，用無菌水洗下抱子，放于4 C下備用； (2) 種子培養；將洗下的抱子，接種于10 g ri玉米漿，5 g 1^1葡萄糖培養基中，28 C 下培養1山作為種子液； (3) 發酵培養：將種子液W 10%的體積比接種于發酵培養基中，在250 ml H角瓶中裝 入50 ml發酵培養基，在28°C、150 r/min條件下發酵培養7 d; 所述發酵培養基配方為：糖混合液10-15 g ri，蛋白腺1 g r\尿素0.3 g r\ (NH4)2S〇4l.4 g 1-1，KH2PO42 g 1-1，M拆〇4*7&0 0. 3 g 1-1，CaCls 0. 4 g 1-1，FeS(V7H2〇 5 mg 1-1，MnS〇4.H2〇 1.7 mg 1-1，ZnS(V7H2〇1.4 mg 1-1，C0CI22 mg 1-1，吐溫80 0. 2 ml 1-1，500 ml 1-1 0.2 M pH 5.0 化2冊〇4-巧樣酸緩沖液。
[0011] 另一種用于誘導生產纖維素酶的糖混合液的應用包括W下步驟： (1) 斜面培養；包含可誘導啟動子的野生型細胞或包含纖維素酶啟動子的構建體在3% 麥芽浸粉固體培養基中在28 C下培養7 d，用無菌水洗下抱子，放于4 C下備用； (2) 種子培養；將洗下的抱子，接種于10 g ri玉米漿，5 g 1^1葡萄糖培養基中，28 C 下培養1山作為種子液； (3)發酵培養：按10%接種量接種至裝液量為3 L發酵培養基的7.5 L發酵罐中，在發 酵的前48 h為菌體生長主要階段，控制發酵溫度為28C，抑利用氨水控制為不低于4,待發 酵罐內糖消耗完后開始補料，所述補料物質為糖混合物，保證發酵罐中糖濃度為1 g ri-2 g rs其中發酵罐轉速W達到發酵液混合均勻為指標，溶氧通過控制氧氣和空氣進氣比例 為 20〇/〇 ; 所述發酵培養基配方為：糖混合液10-15 g ri，蛋白腺1 g r\尿素0.3 g r\ (NH4)2S〇4l.4 g 1-1，KH2PO42 g 1-1，M拆〇4*7&0 0. 3 g 1-1，CaCls 0. 4 g 1-1，FeS(V7H2〇 5 mg 廠1，MnSCV&O 1.7 mg 廠1，ZnS(V7H2〇1.4 mg 廠1，C0CI22 mg 廠1，吐溫80 0. 2 ml 1-1，500 ml 1-1 0.2 M pH 5.0 化2冊〇4-巧樣酸緩沖液。
[0012] 所述包含可誘導啟動子的野生型細胞為包含槐糖可誘導啟動子和葡萄糖可誘導 啟動子的里氏木霉；所述包含纖維素酶啟動子的構建體為包含里氏木霉的CM2啟動子的 細菌，所述細菌為鏈霉菌屬、熱單胞菌屬、芽抱桿菌屬或纖維