一種與中國荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相關的snp分子標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子標記，具體地說，涉及一種與中國荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性 相關的SNP分子標記及其應用。
【背景技術】
[0002] 乳房炎主要是由于病原微生物通過奶牛的乳頭導管或乳頭管以及乳房皮膚外傷 等因素進入奶牛的乳房組織，并在組織內大量繁殖，引起乳腺發生炎癥反應。另外，飼養管 理時奶牛的乳腺組織受到機械刺激或者物理和化學性損傷也會引起奶牛乳房炎。
[0003] 金葡菌產生毒素可以破壞細胞膜，并且可以直接毀壞組織，毒素轉移到管道系統， 毀壞泌乳細胞。金葡菌引起的乳房炎對奶牛群產生的不利影響包括牛奶產量和品質的降低 等，還會影響奶牛正常生理功能并延長產后發情時間，嚴重的會造成奶牛過早淘汰增加牛 群更替成本。
[0004] 又有前人發現被有40%被金葡菌感染的奶牛的SCC反而低于未感染時，因此不能 準確地斷定高低SCC與金葡菌感染之間的關系，這也導致在奶牛生產中不能正確排除感染 金葡菌的奶牛。
[0005] 隨著分子遺傳學、分子生物學技術和數量遺傳學的發展，分子遺傳標記和標記輔 助選擇被廣泛地應用到畜禽育種中，并取得了巨大的成就。Snapshot測序技術是一種基于 熒光標記單堿基延伸原理的分型技術，也稱小測序，主要針對中等通量的SNP分型項目，其 主要原理是將測序酶、四種熒光標記的ddNTP、緊鄰多態位點的延伸引物和PCR產物模板按 一定體系混合，引物延伸一個堿基即終止，經測序儀檢測，根據峰的顏色可以得知參與反應 的堿基種內，從而判斷樣本在該位點的基因型。該方法具有分型準確、通量高、不受SNP位 點多態性特性限制和樣本個數限制等優點。
[0006] 轉運蛋白顆粒復合體9 (TRAPPC9, trafficking protein particle complex 9)基 因是人常染色體隱性精神發育遲滯智力障礙相關的基因，其編碼的蛋白轉運蛋白顆粒復合 體9參與內質網到高爾基體的囊泡轉移和神經細胞的分化，其編碼的蛋白也叫做NIBP (NIK and IKK β-binding protein)，參與膜泡運輸過程，同時具有增強TNF-α活化NF-κ B信號 通路的功能。NF-κ B是重要的核轉錄因子，參與調控大量基因表達，在細胞生存、增殖、分化 和凋亡過程中發揮著重要的生物學功能。目前關于TRAPPC9基因對于金葡菌乳房炎抗性的 影響還沒有報道。

【發明內容】

[0007] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種與中國荷斯坦奶牛金 葡菌乳房炎抗性相關的SNP分子標記及其應用。
[0008] 為了實現本發明的目的，本發明首先提供了一種與中國荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎 抗性相關的SNP分子標記，所述分子標記來自奶牛TRAPPC9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，第165bp位點處的堿基為T或C。
[0009] 本發明還提供了用于擴增所述SNP標記的引物對，所述引物對中正向引物F如SEQ ID No. 2所示、反向引物R如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 本發明還提供了用于檢測所述SNP標記的試劑盒，所述試劑盒含有正向引物F如 SEQ ID No. 2所示、反向引物R如SEQ ID No. 3所示和分型延伸引物如SEQ ID No. 4所示。
[0011] 進一步地，所述試劑盒包括Premix TaqTM、ExoI、FastAP、ExoI buffer和 Snapshot Mix〇
[0012] 本發明還提供了所述SNP標記在鑒定中國荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性優勢品 系中的應用。
[0013] 具體地，包括如下步驟：
[0014] (1)提取待測中國荷斯坦奶牛的基因組DNA ;
[0015] (2)以待測中國荷斯坦奶牛的基因組DNA為模版，利用擴增引物，通過PCR反應擴 增出中國荷斯坦奶牛TRAPPC9基因345bp片段；
[0016] (3)檢測PCR擴增產物，如果擴增產物序列中165bp處的堿基為C，則待測中國荷 斯坦奶牛屬于金葡菌乳房炎抗性高的中國荷斯坦奶牛優勢品系。
[0017] 進一步地，步驟（2)中PCR反應使用的擴增體系以15 μ 1計為：模板DNA 1 μ 1，引 物混合 〇· 151yl，dNTP mix 0.3yl，Taq DNA 聚合酶 0.3yl，10XPCR 反應緩沖液 1·5μ1， MgCl2L 5 μ 1，ddH20 10. 25 μ 1。
[0018] F :5' -TTTATCCTGACGATGTCTGCC-3'
[0019] R :5' -CTGCTGTGAGCCCAAAACTAT-3' ；
[0020] PCR 反應的條件為：95°C 5 分鐘；94°C 15 秒，60°C 15 秒，72°C 30 秒，72°C 30 秒，11 個循環；94°C 15秒，54°C 15秒，72°C 30秒，24個循環；72°C 3分鐘。
[0021] 本發明還提供了所述SNP標記在中國荷斯坦奶牛分子標記輔助育種中的應用。
[0022] 具體地，包括如下步驟：
[0023] (1)采用聚合酶鏈式反應和測序技術篩選到與中國荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性 相關的SNP標記；
[0024] (2)檢測待測中國荷斯坦奶牛的基因型；
[0025] (3)根據基因型進行金葡菌乳房炎抗性高的中國荷斯坦奶牛優勢品系的選育。
[0026] 本發明的有益效果在于：
[0027] 本發明對中國荷斯坦奶牛的TRAPPC9基因的SNP位點進行基因分型，并對該SNP 分子標記與奶牛的金葡菌乳房炎抗性進行關聯分析，分析發現，CC基因型個體的金葡菌乳 房炎抗性顯著高于TT基因型個體（P〈0. 05)，GG基因型個體的體細胞數顯著低于AA基因型 個體（P〈0. 01)。該多態位點的檢出，為中國荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性的標記輔助選擇 提供了科學依據。
【具體實施方式】
[0028] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0029] 實施例1
[0030] I. 1提取待測中國荷斯坦奶牛血液中的基因組DNA
[0031] 將采自中國地區不同奶牛養殖場的共517頭中國荷斯坦奶牛的牛血樣保存 于-20°C，該牛血樣為凝結牛全血，全血分為血凝塊和血清，血凝塊為黯紅色，血清呈清亮黃 色，血液中只有白細胞內含有DNA，白細胞主要存在于血凝塊部分。
[0032] 本試驗采用天根血液DNA樣品提取試劑盒從血凝塊中提取基因組DNA，具體步驟 如下：
[0033] 1)用眼科剪剪取0.2-0. 3mL的凝血塊放入已滅菌的2mL圓底離心管中，加入 500 μ 1的細胞裂解液CL ;
[0034] 2)利用手持勻漿儀將血塊充分勻漿，震蕩15s，12, OOOrpm離心lmin，棄去暗紅色 上清
[0035] 3)再次加入700 μ 1細胞裂解液CL，振蕩器振蕩使沉淀物散開懸浮，12, OOOrpm離 心Imin,棄去上清；
[0036] 4)加入200 μ 1緩沖液GS，用渦旋儀充分懸浮血塊顆粒；
[0037] 5)加入20 μ 1蛋白酶Κ，250 μ 1緩沖液GB，充分晃動混勻；
[0038] 6)將離心管用封口膜封號放入到56°C雜交爐中消化3-4小時，為確保充分消化， 消化過程中需要顛倒混勻數次，最終溶液變成清亮透明，簡短離心；
[0039] 7)加入200 μ 1冰鎮無水乙醇，輕輕上下顛倒混勻15s，此時可能會出現絮狀沉 淀；
[0040] 8)將上一步所得的溶液轉入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12, OOOrpm離心 30s,棄去收集管中廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0041] 9)向吸附柱CB3中加入500 μ 1去蛋白緩沖液⑶，靜置2min，12000rmp離心30s， 棄去收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0042] 10)向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12000rmp離心30s，棄去收集管中的 廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0043] 11)向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液PW，12000rmp離心30s，棄去收集管中的 廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0044] 12)將吸附柱放入收集管中，12000rmp離心2min,棄去廢液，將吸附柱置于室溫放 置數分鐘，徹底發揮吸附柱上殘余的乙醇；
[0045] 13)將吸附柱轉入至一個新的離心管中，加入100 μ 156°C預熱的TE緩沖液，室溫 放置5min，12000rmp離心2min，基因組DNA則存在于離心管中；