一種沉香色酮類成分的制備方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于生物和醫藥技術領域，涉及一種沉香色酮類成分的制備方法，具體涉 及一種利用內生真菌（Botryosphaeria rhodina)A13接種在白木香木肩培養基上產生沉香 組成成分2-(2-苯乙基）色酮類化合物的方法。
【背景技術】：
[0002] 沉香是我國傳統中藥，是"十大廣藥"之一。其藥用始載于《名醫別錄》，列為上品。 其味辛、苦，性微溫，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘功效，用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔 吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥（中國藥典，2010)。沉香藥材的成分復雜，主要包括倍半萜化合 物（揮發性成分）、2-(2_苯乙基）色酮類、芳香族類、三萜類及脂肪酸類化合物，迄今已從 中分離獲得約150個化合物（NaefR，2011)，其中倍半萜類、2-(2_苯乙基）色酮類和芳香族 類化合物是沉香的特征性成分。
[0003] 健康的白木香樹體不能產生沉香類物質，只有受到外界物理、化學傷害或真菌的 刺激作用下才能夠產生。研宄表明，健康白木香木材組織中沒有沉香組成成分，經GC-MS 檢測，其主要成分是棕櫚酸、油酸和亞油酸等脂肪酸（戚樹源，1992)。陶美華等對未結香 的白木香樹枝中通過GC-MS檢測，其主要成分是1-十六烷醇、肉豆蔻酸乙酯、壬酸、2-己 基-1-癸醇等脂肪酸和長鏈化合物（陶美華，2012)。
[0004] 不少研宄顯示沉香屬植物結香與真菌相關。自20世紀30年代起，從沉香屬植物 結香部位中分離到的真菌有葡萄座腔菌（Botryosphaeria rhodina)、鐮刀菌（Fusarium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucor sp.)、青霉（PeniciIlium sp.)、木霉 (Trichoderma sp.)等。王嘉等從白木香不同部位分離到20多株內生真菌（王嘉，2009)， 經結香實驗發現鐮刀菌（F. sp.)、葡萄座腔菌（B.rhodina)促香效果明顯（王磊，2011)。
【發明內容】
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[0005] 本發明的第一個目的是提供內生真菌（Botryosphaeria rhodina)A13接種至白木 香木肩中發酵產生沉香特征成分2-(2-苯乙基）色酮類化合物中的應用。
[0006] 本發明通過實驗發現，將內生真菌B. rhodina A13接種至未結香的白木香木肩中， 經過發酵后，從發酵產物中能夠分離到沉香特征成分-5個2-(2_苯乙基）色酮類化合物： 6-羥基-7-甲氧基-2-(2-苯乙基）色酮（1)，6, 7-二甲氧基-2-(2-苯乙基）色酮（2)， (5S，6R，7S，8R)-2-(2-苯乙基）-5^，6e，7e，8^ -四羥基-5, 6, 7, 8-四羥基色酮（3)， 6-羥基-2-(2-苯乙基）色酮⑷和4'-羥基-2-(2-苯乙基）色酮（5)，其結構如式1所 示：
[0007]
【主權項】
1. 內生真菌（Botryosphaeria rhodina)A13在其接種至白木香木肩中發酵產生沉香 特征成分2-(2_苯乙基）色酮類化合物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的白木香木肩為未結香的白木香木 肩。
3. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的2-(2_苯乙基）色酮類化合 物為6-羥基-7-甲氧基-2-(2-苯乙基）色酮，6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基）色酮， (55,61?，75,81〇-2-(2-苯乙基）-56'，66,76,86 /-四羥基-5,6,7,8-四羥基色酮，6-羥 基-2-(2-苯乙基）色酮和4'-羥基-2-(2-苯乙基）色酮。
4. 一種沉香特征成分2-(2_苯乙基）色酮類化合物的制備方法，其特征在于，將內生真 菌B.rhodinaA13接種至白木香木肩中發酵，得到固體發酵產物，再進行分離純化得到沉香 特征成分2-(2_苯乙基）色酮類化合物。
5. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的白木香木肩為未結香的白木 香木肩。
6. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的2-(2_苯乙基）色酮類化 合物為6-羥基-7-甲氧基-2-(2-苯乙基）色酮，6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基）色酮， (55,61?，75,81〇-2-(2-苯乙基）-56'，66,76,86 /-四羥基-5,6,7,8-四羥基色酮，6-羥 基-2-(2-苯乙基）色酮和4'-羥基-2-(2-苯乙基）色酮。
7. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的分離純化，具體步驟為： 將固體發酵產物用乙醇水溶液浸提，濃縮得發酵物提取物，加水懸浮，先用石油醚萃 取至上層液澄清，再用乙酸乙酯萃取至上層液澄清，石油醚萃取液濃縮得石油醚萃取部分 的浸膏，乙酸乙酯萃取液濃縮得乙酸乙酯部分的浸膏，兩種浸膏分別過硅膠柱，先用石油 醚-乙酸乙酯從 70:1，50:1，30:1，20:1，10:1，7:1，9:2, 3:1，2:1，1:1，1:2 (v/v)梯度洗脫， 再用乙酸乙酯洗脫，最后用二氯甲烷：甲醇=1:1 (v/v)洗脫； 收集石油醚部分的浸膏被石油醚：乙酸乙酯=1:1 (v/V)洗脫下來的P28組分，以二氯 甲烷：甲醇=1:1 (v/v)洗脫過Sephadex LH-20,然后過反相硅膠柱層析，以體積比甲醇：水 =20:80-70:30梯度洗脫，收集70:30梯度洗脫下來的餾分，得到6, 7-二甲氧基-2- (2-苯 乙基）色酮； 收集乙酸乙酯萃取部分的浸膏被石油醚：乙酸乙酯=1:2、1:1和2:l(v/v)洗脫的餾 分E28、E25、E23組份，以及二氯甲烷：甲醇=1:1 (v/v)洗脫的E38組份； E28組分以二氯甲燒：甲醇=l:l(v/v)洗脫過Sephadex LH-20,然后過反相娃膠柱層 析，以體積比甲醇：水=20:80-60:40梯度洗脫，收集60:40梯度洗脫下來的餾分，洗脫餾 分再經制備薄層，得到6-羥基-7-甲氧基-2-(2-苯乙基）色酮； E38組分以二氯甲燒：甲醇=1:1 (v/v)洗脫過Sephadex LH-20，然后過反 相硅膠柱層析，以甲醇：水=20:80(v/v)洗脫，得到（5S，6R，7S，8R)-2-(2-苯乙 基）-5e'，6e，7e，8W -四羥基-5, 6, 7, 8-四羥基色酮； E25組分以二氯甲烷：甲醇=l:l(v/v)洗脫過S印hadex LH-20,經重結晶得到6-羥 基-2-(2-苯乙基）色酮； E23組分以二氯甲燒：甲醇=1:1 (v/v)洗脫過Sephadex LH-20,然后過反相娃膠柱層 析，以體積比甲醇：水=30:70-40:60梯度洗脫，收集40:60梯度洗脫下來的餾分，洗脫餾 分再經制備薄層，得到4' -羥基-2-(2-苯乙基）色酮。
【專利摘要】本發明公開了一種沉香色酮類成分的制備方法。本發明利用未結香的白木香木屑，通過內生真菌B.rhodina A13的接種、固體發酵即可獲得含沉香特征成分-5個2-(2-苯乙基)色酮類化合物的沉香藥材。因此，本發明對于沉香的人工生產、白木香的有效利用具有重要的應用前景和現實意義，同時也為真菌能刺激白木香產生沉香提供重要的科學依據。
【IPC分類】C12R1-645, C12P17-12
【公開號】CN104593443
【申請號】CN201410827739
【發明人】章衛民, 張瑤, 陶美華, 李浩華
【申請人】廣東省微生物研究所
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月25日