一種室內斑點落葉病菌侵染蘋果葉片的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于試驗研宄領域，涉及一種斑點落葉病菌侵染蘋果葉片的方法，專用于 感染斑點落葉病蘋果葉片的獲得。
【背景技術】
[0002] 蘋果斑點落葉病（Alternaria Blotch)是由輪紋病菌的強毒菌系蘋果鏈格孢 (Alternaria mali Roberts，A.mali)侵染而引起的一種世界性分布的氣傳病害，該病危害 蘋果葉片、新梢和幼果，嚴重影響蘋果生產。該病于1924年發現于美國（Roberts，1924)，現 在在全球范圍發生（Filajdic andSutton，1995 ;Rotondo et al·，2012 ;Sawamura，1962) 〇 目前斑點落葉病已是亞洲國家蘋果產區的主要病害（Miyamoto et al，2009;Li et al.， 2〇ll;Filajdi0et al.，1991)。近年來，在我國主要蘋果產區斑點落葉病發生比較普遍， 特殊年份在很多果園造成60 %?70%的落葉，果實的受害程度高達50 %?60% (慕琦， 2008)。加強抗斑點落葉病蘋果品種的研宄和選育對提高蘋果產量、質量有重要的意義。獲 得抗斑點落葉病蘋果品種感病植株，有利于觀察抗病品種在感病時期的表現和生理生化指 標變化，提供抗病品種抗病機制科學研宄，為選育抗病品種提供優良樣本。目前獲得足量、 穩定的抗病品種的感病植株較為困難。斑點落葉病菌在不斷地遺傳進化中形成不同的生理 小種，不同的蘋果品種，同一品種的不同部位對不同的生理小種有不同的抗性（Dalphy et al，2014)。因此高效穩定的斑點落葉病侵染方法尤為重要。
[0003] 目前，對蘋果斑點落葉病的侵染方法主要是參照病原菌致病性處理方法，一般為 孢子懸浮液侵染，包括點接法、噴接法、涂抹法等，需要先將斑點落葉病菌培養一段時間誘 發產生孢子，測定孢子濃度要求在IXlO 5?10 7個/ml。這一方法不僅步驟復雜，而且由于 孢子萌發需要較長時間，溫度濕度要求較高，使斑點落葉病菌孢子懸浮液侵染效率低。

【發明內容】

[0004] 針對現有技術中蘋果斑點落葉病侵染時間長，步驟復雜，效率低等問題，本發明提 供一種高效穩定的室內斑點落葉病菌侵染蘋果葉片的方法，能夠獲得穩定的感、抗病蘋果 品種的感病植株。
[0005] 本發明的目的通過以下技術手段獲得：
[0006] 1、本發明提供一種斑點落葉病菌侵染離體蘋果葉片的方法，該方法步驟為：
[0007] (1)供試材料的處理：將供試蘋果葉齡7d的葉片用無菌水清洗干凈并保持葉片無 水，用無菌水浸濕的脫脂棉將葉柄包上，做保水處理；保水常溫培養2d剔除雜菌污染及機 械損傷葉片；
[0008] ⑵斑點落葉病菌的處理：將斑點落葉病菌接種在PDA培養基，霉菌培養箱26°C培 養7d，取最外圍直徑為4mm菌塊，用作侵染；
[0009] (3)侵染處理：以處理好的菌塊帶菌絲一面貼于步驟（1)處理過的蘋果葉片背面， 分布于主脈兩側約lcm，避開葉脈，在25°C培養箱培養48h，注意保持脫脂棉的濕潤，發現葉 柄剪口處褐化及時剪去褐化部分；
[0010] (4)感病材料獲得：去除已發病葉片上的菌塊，無菌水清洗病斑去除殘留的培養 基，用脫脂棉或吸水紙去除葉片表面水分，獲得感病材料。
[0011] 其中，步驟（1)中培養指的是在保水處理過程，培養箱中常溫培養2d。
[0012] 2、上述1提供的室內斑點落葉病菌侵染蘋果葉片的方法，其中，步驟（2)是選擇活 力強作為侵染菌體侵染葉片。
[0013] 其中，活力強指的是菌落形態：外圍菌絲白色、短而密，以該菌落的形態作為判斷 菌體活力強的標準。
[0014] 3、上述1提供的室內斑點落葉病侵染蘋果葉片的方法，其中，步驟（3)是菌絲直接 接觸葉片，有厚度約I. 5mm培養基提供營養。
[0015] 有益效果：
[0016] 1.本發明直接使用斑點落葉病菌絲塊進行侵染，解決了傳統的孢子侵染萌發率低 而導致侵染效率低的問題，本發明提供的斑點落葉病菌只需接種培養七天左右，即可直接 侵染蘋果葉片，使蘋果葉片感病，發病快，建立了高效、穩定獲得不同蘋果品種感病材料的 技術。
[0017] 2.本發明利用PDA培養基為病菌在侵染過程中持續提供營養，能再次加強侵染效 率，從而解決侵染不穩定的問題。提高了中、高抗斑點落葉病蘋果的侵染率和穩定性，為各 品種蘋果斑點落葉病實驗研宄提供充足、可靠的實驗材料，以確保實驗的順利進行。
[0018] 3.根據國內外不同侵染方法的侵染效率分析，不同的方法，不同品種感病率差別 很大（呂松，2012)。本發明提供的侵染方法與孢子懸浮液滴接法，在不同品種進行對比侵 染實驗，通過總感病位點與總侵染位點比值為感病率，在48h內斑點落葉病菌絲塊侵染的 感病率能達到98%以上，是侵染方法中較為有效的一種，并且在不同抗性品種中感病率相 差不大；而孢子懸浮液滴接法感病率在50%以下，且不同抗性品種感病率差異很大。
【附圖說明】
[0019] 圖1為菌絲塊侵染蘋果葉片流程圖。
[0020] 圖2為斑點落葉病菌接種7d菌塊選擇位置。
[0021] 圖3為材料處理及侵染示意圖。
[0022] A :未經處理蘋果葉片；B :蘋果葉片經無菌水及浸濕脫脂棉處理C :菌絲塊接種位 點選擇及接種。
[0023] 圖4為不同品種侵染效果圖。
[0024] A :紅星品種侵染24h后效果圖；B :紅玉品種侵染24h后效果圖；C :紅星品種侵染 48h后效果圖；D :紅玉品種侵染48h后效果圖。
[0025] 圖5為孢子懸浮液侵染不同品種。
[0026] A :紅星品種侵染48h后效果圖；B :紅玉品種侵染48h后效果圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合實施例對本發明做進一步說明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照本領域的公知手段。
[0028] 實施例I
[0029] 蘋果高感品種'紅星'室內感病葉片的獲得。
[0030] (1)供試材料的處理：選擇一年生枝條距頂端完全展開葉第3?4 (約7d葉齡）健 康蘋果'紅星'品種葉片作為實驗材料。將'紅星'葉片用無菌水清洗，去除葉片表面的灰 塵，用無菌吸水紙或脫脂棉吸去葉片表面的水分。用浸濕的脫脂棉將葉柄包起，以確保葉片 在侵染期間的水分供應。剔除處理過程中受傷的葉片。
[0031] ⑵斑點落葉病菌的處理：將保存的斑點落葉病菌接種在PDA培養基（馬鈴薯浸 出粉3g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂粉1