專利名稱：蛇毒細胞毒素-ctx1在制備具有鎮痛作用藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛇毒細胞毒素-CTX1在制備具有鎮痛作用藥中的應用，具體涉及蛇毒細胞毒素-CTX1在制備對傷害性刺激導致的軀體痛、內臟痛以及對嗎啡成癮后疼痛具有鎮痛作用的藥中的應用。

背景技術：
蛇毒是一個巨大的生物資源寶庫。自1968年英國科學家首先研制成功了治療血管閉塞性疾病的蛇毒制劑-ARIN，投放市場后不久即獲得了巨大的經濟回報。近十年來，隨著多達數十種蛇毒藥品的面世，并且取得了不俗的臨床療效和銷售業績，從蛇毒中開發出價廉、物美的特效藥正在成為各國生物學家、藥學家及制藥企業爭相追逐的新熱點。
舟山眼鏡蛇(Naja atra Cantor)，以頸部背面有白色眼鏡架狀斑紋為其最明顯的特征，體長可達2米，主要分布于我國長江以南諸省及臺灣等地。舟山眼鏡蛇所分泌的蛇毒液中含有多種神經毒素(neurotoxin，NT)及細胞毒素(Cytotoxin，CTX)，由于CTX對多種組織細胞膜均有較強的破壞共性，尤其對心肌細胞更為顯著，故又稱為膜毒素(Membrane toxin)或心臟毒素(cardiotoxin)。從我國大陸及臺灣產舟山眼鏡蛇毒中至少已分離出了5～7種不同的CTX，均由60～63個氨基酸殘基組成，相對分子質量為6000～7000kDa。
二十世紀70年代以來，蛇毒中有效單體-NT在鎮痛的基礎研究方面已有較多報道，其鎮痛機制可能與膽堿能、內源性阿片肽等多種系統有關。與傳統鎮痛藥物嗎啡相比，NT的鎮痛具有用量少、止痛時間長、無成癮性等特點，對頑固性疼痛、神經性疼痛和惡性腫瘤痛均有效。但鑒于NT的神經毒性較大，致死活性較強，其的安全性一直有較大爭議。
1975年，Hayashi首次報道了從臺灣眼鏡蛇毒Naja naja atra中純化出一種CTX，是一種強堿性多肽毒素pI 9.0，相對分子質量為6693kDa，有60個氨基酸殘基LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCIDVCPKNSLLVK YVCCNTDRCN，并命名為CTX1；進一步研究發現泰國眼鏡蛇(Naja naja siamensis)毒中亦含此毒素。目前CTX1是否有鎮痛的功能，至今未見相關報道。


發明內容
本發明的目的在于提供蛇毒細胞毒素-CTX1在制備具有鎮痛作用藥中的應用，該細胞毒素-CTX1對傷害性刺激導致的軀體痛、內臟痛及嗎啡成癮后疼痛均有較好的鎮痛作用，將其開發為新的鎮痛藥具有較好的應用前景。
實際上，本發明蛇毒細胞毒素-CTX1在制備具有鎮痛作用藥中的應用。
優選的，本發明所述的應用是指在制備對傷害性刺激導致的軀體痛具有鎮痛作用藥的應用。
優選的，本發明所述的應用是指在制備對傷害性刺激導致的內臟痛具有鎮痛作用藥的應用。
優選的，本發明所述的應用是指在制備對嗎啡成癮后疼痛具有鎮痛作用藥的應用。
本發明所述的蛇毒細胞毒素-CTX1通過中國大陸舟山眼鏡蛇蛇毒的分離和純化獲得，其具體過程為 (1)凝膠過濾采用Sephacryl S-100HR填料，將舟山眼鏡蛇毒樣本通過AKTA explorer 100快速純化工藝開拓系統進行分子篩過濾，獲得I、II、III三個毒性組分，分別用G-50預裝柱HiPrep 26/10Desaltin脫鹽，凍干，備用； (2)離子交換將步驟(1)所得三個毒性組分根據毒性強弱初篩，選取毒性最強的組分III，采用CM Sepharose FF填料，通過AKTA explorer 100快速純化工藝開拓系統進行離子交換，獲得單一毒性的多肽CTX1，并用G-50預裝柱HiPrep 26/10Desaltin脫鹽，凍干即可。
本發明的有益效果是 (1)該蛇毒細胞毒素CTX1對各種急、慢性疼痛的具有良好的鎮痛作用，尤其是CTX1對傷害性刺激導致的軀體痛(somatalgia)、內臟痛(visceral pain)及嗎啡成癮后疼痛(疼痛癥狀群)均有較強鎮痛作用。
(2)由于CTX1分子中并不存在類似于內源性阿片肽的氨基酸序列(TGGP)片斷，對嗎啡成癮的動物不但能發揮較強的鎮痛效應，并且連續用藥12天亦未見成癮、耐受現象，故將其開發為新的鎮痛藥有較好的應用前景。



圖1是CTX1在CM Sepharose FF離子交換色譜圖； 圖2是質譜分析法(MALDI-TOF)測定CTX1的質譜圖。

具體實施例方式 以下實施例僅用于闡述本發明，而本發明的保護范圍并非僅僅局限于以下實施例。所述技術領域的普通技術人員依據以上本發明公開的內容均可實現本發明的目的。
第一部分蛇毒細胞毒素-CTX1的制備及其分子量和氨基酸序列的測定 1.1蛇毒細胞毒素-CTX1的制備 從大陸舟山眼鏡蛇自然野生分布優勢區域之一的湛江地區野外采集舟山眼鏡蛇毒樣本，進行以下分離和純化得到CTX1 (1)凝膠過濾采用Sephacryl S-100HR填料，將舟山眼鏡蛇毒樣本通過AKTA explorer 100快速純化工藝開拓系統(制備型高效液相色譜儀)進行分子篩過濾，獲得I、II、III三個毒性組分，分別用G-50預裝柱HiPrep 26/10 Desaltin脫鹽，凍干，備用； 其中柱規格為26×100mm，先用0.05M pH6.4磷酸緩沖液兩個柱體積平衡凝膠柱，蛇毒樣品溶液通過AKTA explorer-100色譜儀的上樣泵上樣，泵速為0.6ml/min，洗脫泵速0.6ml/min，紫外檢測波長280nm，每管收集量6ml/min。
(2)離子交換將步驟(1)所得三個毒性組分通過初篩，選取毒性最強的組分III，采用CM Sepharose FF填料，通過AKTA explorer 100快速純化工藝開拓系統進行離子交換，獲得單一毒性的多肽CTX1，并用G-50預裝柱HiPrep 26/10Desaltin脫鹽，凍干即可。
其中，柱規格26×100mm，先用0.05M pH6.4磷酸緩沖液兩個柱體積平衡凝膠柱，組分III100mg樣品溶液通過AKTA explorer-100色譜儀的上樣泵上樣，泵速為0.8ml/min，用1000mL含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L pH為8.0的PBS和1000mL0.02mol/L pH為8.0的PBS進行梯度洗脫，洗脫泵速0.8ml/min，紫外檢測波長280nm，每管收集量8ml/min，獲得CTX1的色譜圖如附圖1所示。
1.2蛇毒細胞毒素-CTX1的分子量及氨基酸序列的測定 用質譜分析法(MALDI-TOF)測定CTX1的分子量為6697.915kDa，其質譜圖如附圖2所示； 用埃德曼降解法(Edman degradation)測定CTX1的氨基酸序列為LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVKYVCCNTDRCN。
與從臺灣舟山眼鏡蛇毒中純化出的CTX1相比，來源于大陸湛江地區舟山眼鏡蛇毒CTX1的分子質量有約3kDa的差異，二者的氨基酸序列一致。
第二部分蛇毒細胞毒素-CTX1的鎮痛作用 實施例1 本實施例通過醋酸扭體法測試CTX1對小鼠的因傷害性刺激導致的內臟痛的鎮痛作用。
動物經腹腔注射醋酸溶液后，可以模擬腹腔炎癥引起的腹腔內臟痛癥狀，常用于新鎮痛藥物的篩選。通過觀察藥物處理組與對照組扭體癥狀的差別，可以確定該藥物是否具有鎮痛效應以及其劑量-效應曲線。
取小鼠(體重20-25g，雌雄均可)經腹腔注射不同劑量CTX1(實驗組)、嗎啡(陽性對照組)或生理鹽水(陰性對照組)，30min后，各組動物再經腹腔注射0.1ml 0.6％的醋酸(acetic acid)溶液。醋酸溶液處理后，小鼠分別置于玻璃燒杯內使其適用5min，然后觀察10min，記錄該時段出現典型扭體癥狀的次數，為了便于記錄，腹部和后肢因刺激而伸展一次定義為一次扭體反應。
表1醋酸扭體法測試CTX1對小鼠的鎮痛作用
備注*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，與控制組相比較。
如上表1所示的實驗結果表明提前30min應用CTX1，高(0.4mg/kg)、中(0.2mg/kg)、低(0.1mg/kg)3個劑量組對醋酸所致小鼠扭體次數與生理鹽水對照組比較明顯減少，具有顯著差異(p＜0.01～0.001)，劑量-效應關系明顯，該結果提示CTX1對醋酸所致小鼠內臟疼痛有明顯抑制作用。
以上藥理學實驗研究表明，CTX1對傷害性刺激導致的內臟痛(visceral pain)有較強鎮痛作用，在治療疼痛方面有新用途。
實施例2 本實施例通過熱板法測試CTX1對大鼠的因傷害性刺激導致的軀體痛及嗎啡成癮后疼痛(疼痛癥狀群)的鎮痛作用。
熱板法是鎮痛藥物篩選，檢測中常用的一種方法，也是一種能確定區分中樞神經和末梢神經鎮痛機理的方法，有較寬的使用范圍，小鼠受熱刺激后可出現舔后足或縮爪等典型軀體痛覺反應。測定熱痛反應潛伏期的長短(s)，與動物的痛閾變化相一致。
取正常及嗎啡成癮后大鼠(雄性，體重180～220g)放置于UGO痛覺測試儀的金屬熱板(表面溫度為55±0.5℃)上，開始記時，直至大鼠舔后足或縮爪，停止記時，這段時間為該只大鼠的潛伏期。實驗中，給藥前先測定大鼠基礎潛伏期，潛伏期大于30s則淘汰。各組大鼠在實驗中不同階段測定給藥后潛伏期，為了避免大鼠后足被燙傷，確定55s為中斷時。
表2熱板法測試CTX1對大鼠的鎮痛作用(x±s)
備注*p＜0.05，**p＜0.01，與控制組相比較。
如上表2所示的實驗結果表明強效鎮痛藥嗎啡及CTX1(0.2mg/kg)均可顯著提高痛閾，延長熱痛反應時間，該結果提示CTX1對傷害性熱刺激所致的軀體痛有明顯的抑制作用。
以上藥理學實驗研究表明，CTX1對傷害性刺激導致的軀體痛(omatalgia)及嗎啡成癮后疼痛(疼痛癥狀群)均有較強鎮痛作用，在治療疼痛方面有新用途。
由于CTX1分子中并不存在類似于內源性阿片肽的氨基酸序列(TGGP)片斷，對嗎啡成癮的動物不但能發揮較強的鎮痛效應，并且連續用藥12天亦未見成癮、耐受現象，故將其開發為新的鎮痛藥有較好的應用前景。
實施例3 本實施例通過機械刺激法測試CTX1因大鼠對嗎啡成癮引起疼痛的鎮痛作用。
機械刺激機械縮腿閾值(paw withdrawal threshold，PWT)測定參照文獻報道的“Up-Down”法，將大鼠置于金屬網上，蓋以透明的有機玻璃罩。首先讓大鼠適應環境15min，待大鼠梳理和探究活動基本消失后，用一系列標準化的vonFrey測試探針刺激大鼠神經損傷側后肢足底中部，使其彎曲成S形，持續6～8S，觀察縮足反應，大鼠在刺激時間內或在移開vonFrey針時立即出現快速的縮足反應，記為陽性反應，而身體活動引起的縮足反應不記做陽性反應。直至找到該鼠出現50％測量10次至少有連續5次縮足)縮足反應的探針，記錄其壓力值(g)，此值即為該鼠損傷側的縮腿閾值。
表3CTX1不同劑量對嗎啡成癮大鼠痛域的影響(％)(x±s)
備注*p＜0.05，**p＜0.01，與嗎啡成癮前相比較 如上表3所示的實驗結果表明各組大鼠給藥前痛域無明顯差異(P＞0.05)，嗎啡組與CTX1各劑量組在連續8天嗎啡位置偏愛訓練后，大鼠對嗎啡成癮后第10～18天，嗎啡組大鼠在痛覺測試儀上抬腳時間縮短，痛覺敏化，對痛覺反應強；而CTX1各組對嗎啡成癮大鼠痛覺敏化有較強的鎮痛作用，有一定的劑量依賴性，連續8天給藥后鎮痛作用顯著，CTX1(0.4mg/kg)增長到244.8±17.5％，CTX1(0.2mg/kg)也增長到249.5±37.1％，CTX1(0.1mg/kg)增加到168.9±15.5％，與N.S組比較明顯增加(P＜0.05)與大鼠成癮給CTX1處理前相比有顯著性差異(P＜0.01)，以嗎啡成癮后第一天痛域值為100觀察其余各天痛域的增加百分值。發現CTX1(0.2mg/kg)和CTX1(0.4mg/kg)組嗎啡成癮后痛敏的鎮痛作用比CTX1(0.1mg/kg)強(p＜0.05)，但二者鎮痛作用組間差異性不大.在停止給CTX1后，CTX1鎮痛作用降低。但CTX1(0.4mg/kg)降低幅度較小說明劑量較大時鎮痛維持效果好。結果表明CTX1對于嗎啡成癮后痛覺過敏有良好的鎮痛作用，對于長期吸毒的患者在剛戒毒時出現痛覺過敏較強不能自持而去尋藥有良好的控制作用。
以上實施例表明蛇毒細胞毒素-CTX1具有鎮痛作用，即該細胞毒素-CTX1對傷害性刺激導致的軀體痛、內臟痛及嗎啡成癮后疼痛均有較強的鎮痛作用，且連續用藥12天未見成癮、耐受現象，將其開發為新的鎮痛藥具有較好的應用前景。
權利要求
1.蛇毒細胞毒素-CTX1在制備具有鎮痛作用藥中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的應用是指在制備對傷害性刺激導致的軀體痛具有鎮痛作用藥中的應用。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的應用是指在制備對傷害性刺激導致的內臟痛具有鎮痛作用藥中的應用。
4.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的應用是指在制備對嗎啡成癮后疼痛具有鎮痛作用藥中的應用。
5.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的蛇毒細胞毒素-CTX1通過中國大陸舟山眼鏡蛇蛇毒的分離和純化獲得，其具體過程為
(1)凝膠過濾采用Sephacryl S-100HR填料，將舟山眼鏡蛇毒樣本通過AKTA explorer 100快速純化工藝開拓系統進行分子篩過濾，獲得I、II、III三個毒性組分，分別用G-50預裝柱HiPrep 26/10 Desaltin脫鹽，凍干，備用；
(2)離子交換將步驟(1)所得三個毒性組分根據毒性強弱初篩，選取毒性最強的組分III，采用CM Sepharose FF填料，通過AKTA explorer 100快速純化工藝開拓系統進行離子交換，獲得單一毒性的多肽CTX1，并用G-50預裝柱HiPrep 26/10 Desaltin脫鹽，凍干即可。
全文摘要
本發明公開了蛇毒細胞毒素-CTX1在制備具有鎮痛作用藥中的應用，尤其是蛇毒細胞毒素-CTX1在制備對傷害性刺激導致的軀體痛、內臟痛以及對嗎啡成癮后疼痛具有鎮痛作用的藥中的應用，該細胞毒素-CTX1對傷害性刺激導致的軀體痛、內臟痛及嗎啡成癮后疼痛均有較好的鎮痛作用，且連續用藥12天未見成癮、耐受現象，將其開發為新的鎮痛藥具有較好的應用前景。
文檔編號C07K1/36GK101757610SQ200910215379
公開日2010年6月30日 申請日期2009年12月23日 優先權日2009年7月29日
發明者劉先國, 孔天翰, 信文君, 仲維高, 崔躍, 董偉華, 黃紹, 崔超偉, 唐婭 申請人:中山大學