一種非抗性篩選kiss1真核表達質粒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因疫苗領域。具體涉及一種非抗性篩選KISS1真核表達質粒，含有 該真核表達質粒的重組大腸桿菌，以及該重組大腸桿菌在制備動物免疫去勢基因疫苗中的 應用，本發明還涉及一種動物免疫去勢基因疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002] 家畜去勢術在我國具有久遠的歷史，最早記載于夏代《夏小正》中，把對公畜去勢 稱為攻駒或攻特。目前，家畜去勢方法還主要沿用手術閹割。中國家畜年出欄量巨大，其中 包括6億頭豬和3億頭羊（米春改.全國畜牧業發展概況.中華人民共和國年鑒，2012)。 畜牧生產中主要對公畜去勢，母畜基本不去勢。每年大約就有3億頭公豬和1億頭公羊采 取手術去勢，工作量巨大，成本很高，而且易感染。同時，規模化標準化生產中動物福利、成 本控制、熟練勞動力稀缺等新需求和新形勢迫使開發方便高效，成本低廉的去勢新技術和 新方法。在眾多去勢方案中，激素免疫去勢在規模化標準化大生產中最有應用潛力。免疫 去勢的技術關鍵在于免疫靶標的選擇。激素免疫去勢主要以下丘腦-垂體-性腺軸中的 生殖激素成員為靶標（靶基因或靶蛋白）。GnRH、FSH和LH是免疫去勢常用的靶標（韓 燕國，等.動物GnRH-I免疫去勢的研宄進展.生理科學進展，2013,44(5):399-401;姜勛 平，等.基因免疫原理和方法.北京：科學出版社，2004)。FSH或LH蛋白疫苗免疫后在 抑制動物睪酮分泌、精子發生和精液品質上均有一定的抑制效果（FalvoRE，等.Effect ofactiveimmunizationagainstLHRHorLHinboars:reproductiveconsequences andperformancetraits.JAnimSci, 1986,63(3) :986-94；FerroVA.Current advancesinantifertilityvaccinesforfertilitycontrolandnoncontraceptive applications.ExpertRevVaccines，2002, 1 (4) :443-52)D 但是，它們的共同問題是免疫 動物后抗體水平不高，去勢效果不明顯。于是，研究者除了尋找改善免疫效果的方法外， 更多地將研究視角轉向生殖軸的上一級成員GnRl獸用GnRH蛋白疫苗（如Improvac和 Bopriva)已經可以達到去勢的目的（BruniusC，等.Earlyimmunocastrationofmale pigswithImprovac(?)-effectonboartaint,hormonesandreproductiveorgans. Vaccine，2011，29(51) :9514-20)。但是，這種蛋白型去勢疫苗操作復雜，成本高。鑒于此， 研究者構建了低成本的GnRH基因疫苗用于動物免疫去勢，試驗結果表明受免小鼠雄激素 水平降低、睪丸萎縮和精子發育受阻等（葉文劍等.GnRH基因疫苗構建及免疫去勢效果 評價.武漢：華中農業大學圖書館，2012;KhanMAH，等?Immunisationwithaplasmid DNAvaccineencodinggonadotrophinreleasinghormone(GnRH-I)andT-helper epitopesinsalinesuppressesrodentfertility.Vaccine, 2008, 26(10):1365-1374 ； KhanMAH,等?ImmunisationofmalemicewithaplasmidDNAvaccineencoding gonadotrophinreleasinghormone(GnRH-I)andT-helperepitopessuppresses fertilityinvivo.Vaccine，2007,25(18):3544-53)，但沒有完全抑制精子的發生。因 此，為了使開發的基因疫苗達到免疫去勢的目的，必須提高基因疫苗在機體內表達效率 或尋找新的免疫去勢靶標。KISS1由下丘腦分泌，處于生殖軸控制的最上游，通過控制GnRH的分泌起到繁殖控制開關的決定性作用，將其敲出或突變后嚴重降低了動物的繁 殖性能(SuzukiS,等?Directkisspeptin-lOstimulationonluteinizinghormone secretionfrombovineandporcineanteriorpituitarycells.AnimalReproduction Science, 2008, 103(3-4) :360-5；ClarkeIJ,等?Kisspeptinstimulatesovulationin seasonallyacylicewes.InProc89thAnnualMeetingoftheEndocrineSociety. Toronto,Ontario,Canada, 2007；LapattoR,等?Kissl-/_miceexhibitmorevariable hypogonadismthanGpr54-/_mice.Endocrinology, 2007, 148(10) :4927-36)。對于免疫去 勢疫苗的靶標而言，下丘腦-垂體-性腺軸上游的激素成員用于免疫去勢的效果上游要比 下游的好，例如GnRH免疫去勢效果就比FSH或LH的好。由此推論，用處于生殖軸最上游的 KISS1基因免疫去勢效果可能比GnRH還好。為此，需進一步用基因免疫的新方法展開KISS1 新靶標免疫去勢效果的研宄。
[0003] 免疫去勢基因疫苗（如GnRH)的載體中普遍存在著抗性篩選標志基因（Amp 或Kan)。在培養細菌的過程中需要添加此類抗性物質來篩選重組菌，不僅增加了成 本，也有可能導致臨床抗藥菌株的播散和基因疫苗產品制備過程中潛在的痕量過敏 現象(HanYG,等.EfficacyandsafetyofanoralsomatostatinDNAvaccine withoutantibioticresistancegeneinpromotinggrowthofpiglets.ScandJ Immunol, 2014, 79(4) : 244-50)，從而不利于疫苗的推廣應用。因此，關于攜帶目的基因的 載體尚需進一步研宄改進。此外，免疫去勢基因疫苗中的靶標（如GnRH)通常分子量小， 免疫原性弱，為了保證其較好的免疫原性，免疫去勢基因疫苗中的靶標需要同大分子載體 連接起來。大量研宄證明，基因疫苗的靶標與大分子的乙肝表面抗原S基因結合能夠有效 提高疫苗的免疫原性（LiangAX，等?Constructionandevaluationoftheeukaryotic expressionplasmidencodingtwocopiesofsomatostatingenesfusedwith hepatitisBsurfaceantigengeneS.Vaccine, 2008,26:2935 - 41)〇

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是構建一種新的、針對免疫去勢上游靶標KISS1的基因疫苗，本發 明還提供一種非抗性篩選KISS1真核表達質粒，以及含有該真核表達質粒的重組大腸桿 菌。
[0005] 本發明動物免疫去勢基因疫苗的構建過程為：先將合成的人KISS1基因克隆到 真核表達載體PVAX1的Hindlll和EcoRI酶切位點中，得到質粒pVAX-KISSl;再將從質粒 pCMV-S擴增的乙肝表面抗原S基因克隆到質粒pVAX-KISSl的Nhel和Hindlll酶切位點 中，得到中間質粒pVAX-KISSl-S;之后用非抗性篩選基因--天冬氨酸0 _半乳糖脫氫酶 基因（asd)替換中間質粒pVAX-KISSl-S中的卡那霉素基因（Kan)，得到非抗性篩選KISS1 真核表達質粒pVAX-KISSl-S-asd(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示），再將真核表達質 粒pVAX-KISSl-S-asd轉化至缺失asd基因的大腸桿菌內，篩選陽性克隆，即得到含有非抗 性篩選KISS1真核表達質粒pVAX-KISSl-S-asd的大腸桿菌菌株x6097/pVAX-KISSl-S-asd; 將該菌株擴大培養，用堿裂解法大量提取質粒pVAX-KISSl-S-asd，即得到動物免疫去勢基 因疫苗，并將該基因疫苗應用于湖羊公羊進行臨床驗證，從而完成本發明。
[0006] 申請人制備了一株含有非抗性篩選KISS1真核表達質粒pVAX-KISSl-S-asd的大 腸桿菌（Escherichiacoli)菌株x6097/pVAX-KISSl-S_asd，于 2014 年 10 月 21 日送交 湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC N0:M2014503〇
[0007] 本