專利名稱:一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法
技術領域：
本發明屬于固定化酶技術領域：
，具體涉及以精氨酸修飾交聯殼聚糖微球為載體，制備共固定化葡萄糖氧化酶(GOD)/過氧化氫酶(CAT)微球的技術。
背景技術：
固定化酶是將可溶性的酶束縛于水不溶性載體上的新型生物催化劑，與只能使用一次的游離酶相比較，固定化酶既具有游離酶的催化特性，又具有穩定性好、可反復利用等優點，還可實現生產工藝的連續化、自動化，是生物催化劑的主要發展方向。
葡萄糖氧化酶(GOD)專一性催化β -D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。在食品行業，用于面粉改良、海產品保鮮、測定發酵液中糖含量；在醫藥領域，用于制備尿糖、血糖檢測試紙及口腔疾病防治；在生物技術領域：
，作傳感器電極等。過氧化氫酶(CAT)，專一性催化過氧化氫分解為水和氧氣，用于去除殘留的過氧化氫，廣泛應用于紡織印染、造紙、廢水處理、牛奶保鮮以及臨床分析等方面。在GOD的催化反應體系中，引入CAT，即將兩種酶固定于同一體系中，實現共固定化。這樣GOD催化反應生成的過氧化氫，擴散至CAT微環境的距離縮短，兩種酶的催化效率都得到提高。
現有的制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的工藝，例如《浙江大學學報(工學版)》2002年第2期中的“葡萄糖氧化酶-過氧化物酶膜共固定化的研究” 一文中，公開的方法是將葡萄糖氧化酶和過氧化物酶共同固定在尼龍-66薄膜載體上，用于制備檢測血糖濃度的試紙等。該方法的缺點是尼龍的強疏水性導致固定化酶的損失大，加之酶直接固定于膜表面，與膜表面的距離太近，形成大量細小窄縫，會阻礙血液大分子的傳遞，甚至導致阻塞；此外兩個酶隨機固定于膜上`，葡萄糖氧化酶產生的過氧化氫需要擴散較長的時間和距離才能到達過氧化物酶的活性中心，響應時間長。又如2008年10月15日公開的公開號為CN101285060的“殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法”專利，公開的方法是用半交聯法先制備出殼聚糖-精氨酸陰離子微球，然后以該微球為載體，以二環己基碳二亞胺為交聯劑，制備固定化胰凝乳蛋白酶的工藝。該法的優點是以"柔性手臂"的精氨酸殘基固定化胰凝乳蛋白酶，獲得的固定化酶具有作用范圍較大、活力回收高、穩定性好等優點，說明殼聚糖-精氨酸陰離子樹脂是性能優良的固定化酶載體。該方法的主要缺點是，載體只固定了一個酶，而在相同的條件下，同種酶帶有相同電荷，相互排斥，難以實現氨基的充分利用。

發明內容
本發明的目的是針對現有共固定化葡萄氧化酶和過氧化物酶的不足之處，提供一種以殼聚糖-精氨酸陰離子微球為載體，制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化物酶(G0D/CAT)微球的方法，該方法具有反應條件溫和，酶活力回收較高，固定化酶半衰期長，操作簡單，成本較低，清潔安全等特點。
本發明的原理接枝于交聯殼聚糖上的精氨酸殘基含有兩個游離氨基，精氨酸殘基的兩氨基之間相隔4個碳-碳鍵與一個碳-氮鍵，均可分別接受GOD或CAT，因此，可通過交聯劑戊二醛分別與精氨酸殘基及酶表面的氨基反應，形成固定化酶；即以該微球為載體，可制備出共固定化G0D/CAT ；共固定化酶中的GOD氧化葡萄糖為葡萄糖酸并產生過氧化氫，CAT分解過氧化氫為氧氣及水，從而保證GOD的穩定性及高活性。
本發明的目的是這樣實現的一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，以殼聚糖-精氨酸陰離子微球為載體，加入GOD和CAT混合溶液及戊二醛，經交聯反應、過濾、洗滌、冷凍干燥，制備出共固定化GOD和CAT微球。其具體的方法步驟如下
(I)制備殼聚糖-精氨酸陰離子微球
依據《應用化學》2009年7月第26卷第7期公開的“殼聚糖_精氨酸樹脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性質” 一文，制備出殼聚糖-精氨酸陰離子微球。
(2)配制GOD和CAT混合溶液
第(I)步完成后，按照GOD CAT的活力比為1:1 6的比例，將GOD和CAT溶解于pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，收集含GOD和CAT的溶解液。對于收集的含GOD和CAT的混合溶液，用于制備共固定化G0D/CAT。
(3) GOD和CAT共固定化
第(2)步完成后，按照第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質量(g)第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積(mL)比為1: 3 8的比例，先將殼聚糖-精氨酸陰離子微球分散于含GOD和CAT的混合溶液中，攪拌吸附30 60分鐘后，再按照戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 5 10的比例，將戊二醛溶液加入分散液中，在4 10°C下，反應2 3小時，用于GOD和CAT的共固定化，收集反應液。對于收集的反應液，用于制備共固定化G0D/CAT微球。
(4)制備共固定化G0D/CAT微球
第(3)步完成后，將第(3)步收集的反應液，進行過濾，棄濾液，收集濾渣。對于收集的濾渣，用pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌3 5次，用于除去未固定的G0D/CAT，分別收集洗滌液和洗滌渣。對于收集的洗滌液，調節pH為3 8后，再次用于第(2)步；對于收集的洗滌渣，在溫度為-40 _50°C、真空度為20 50Pa的條件下，進行冷凍干燥24 30小時，就制備出殼聚糖-精氨酸樹脂共固定化G0D/CAT微球。其中共固定化葡萄糖氧化酶的活力回收以GOD活力計為60. 25% 69. 37%。
本發明主要有以下效果
1、本發明方法充分利用了精氨酸作為“柔性手臂”，實現了在“柔性手臂”上的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的共固定化，減小了固定化酶的空間位阻效應。
2、本發明充分利用了 GOD與CAT催化反應的協同性，消除了 H2O2對GOD活性的破壞，共固定化酶的活力回收高，顯著延長了共固定化G0D/CAT的使用壽命，可反復使用29 45次、連續使用45 70小時，生產成本低，有利于可持續發展。
3、本發明實現了兩種酶共固定于同一體系中。CAT微環境中的底物由距離很近的GOD催化反應生成，兩種酶的穩定性及催化效率均得以提高，從而提高了工業生產效率。
4、本發明具有方法簡單易行、反應條件溫和、設備簡單易得、無“三廢”排放等特點，是一種綠色環保的生產方法。
采用本發明方法制備出的產品，可廣泛應用于醫藥、食品，水處理、水泥等行業中。還能作為除葡萄糖、脫氧、殺菌劑、葡萄糖定量分析試劑等。
四具體實施方式
下面結合具體實施方式
，進一步說明本發明。
實施例1
一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，具體方法步驟如下
(I)制備殼聚糖-精氨酸陰離子微球
依據《應用化學》2009年7月第26卷第7期公開的“殼聚糖_精氨酸樹脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性質” 一文，制備出殼聚糖-精氨酸陰離子微球。
(2)配制GOD和CAT混合溶液
第(I)步完成后，按照GOD CAT的活力比為1:1 6的比例，將GOD和CAT溶解于pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，收集含GOD和CAT的溶解液。對于收集的含GOD和CAT的混合溶液，用于制備共固定化G0D/CAT。
(3) GOD和CAT共固定化
第(2)步完成后，按 照第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質量(g)第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積(mL)比為1: 3 8的比例，先將殼聚糖-精氨酸陰離子微球分散于含GOD和CAT的混合溶液中，攪拌吸附30 60分鐘后，再按照戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 5 10的比例，將戊二醛溶液加入分散液中，在4 10°C下，反應2 3小時，用于GOD和CAT的共固定化，收集反應液。對于收集的反應液，用于制備共固定化G0D/CAT微球。
(4)制備共固定化G0D/CAT微球
第(3)步完成后，將第(3)步收集的反應液，進行過濾，棄濾液，收集濾渣。對于收集的濾渣，用pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌3 5次，用于除去未固定的G0D/CAT，分別收集洗滌液和洗滌渣。對于收集的洗滌液，調節pH為3 8后，再次用于第(2)步；對于收集的洗滌渣，在溫度為-40 _50°C、真空度為20 50Pa的條件下，進行冷凍干燥24 30小時，就制備出殼聚糖-精氨酸樹脂共固定化G0D/CAT微球。其中共固定化葡萄糖氧化酶的活力回收以GOD活力計為60. 25% 69. 37%。
實施例2
一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，同實施例1，其中
第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 4，將GOD和CAT溶解于pH 5的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中；
第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 5mL,攪拌吸附45分鐘后戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 7，在7°C下，反應2. 5小時；
第⑷步中，用pH 5的O. 2mol/L磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖溶液液洗滌4次，冷凍干燥機的溫度為_45°C、真空度為35Pa，進行冷凍干燥27小時。
實施例3
一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，同實施例1，其中[0040]第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 6，將GOD和CAT溶解于pH 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中；
第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 8mL，攪拌吸附60分鐘后戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 10，在10°C下，反應3小時；
第(4)步中，用pH 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌5次，冷凍干燥機的溫度為_50°C、真空度為50Pa，進行冷凍干燥30小時。
權利要求
1.一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，其特征在于具體方法步驟如下 (1)制備殼聚糖-精氨酸陰離子微球 依據《應用化學》2009年7月第26卷第7期公開的“殼聚糖_精氨酸樹脂固定化胰凝乳蛋白酶及其性質” 一文，制備出殼聚糖-精氨酸陰離子微球； (2)配制GOD和CAT混合溶液 第⑴步完成后，按照GOD CAT的活力比為1:1 6的比例，將GOD和CAT溶解于pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，收集含GOD和CAT的溶解液； (3)GOD和CAT共固定化 第(2)步完成后，按照第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 3 8mL的比例，先將殼聚糖-精氨酸陰離子微球分散于含GOD和CAT的混合溶液中，攪拌吸附30 60分鐘后，再按照戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 5 10的比例，將戊二醛溶液加入分散液中，在4 10°C下，反應2 3小時，用于GOD和CAT的共固定化，收集反應液； (4)制備共固定化G0D/CAT微球 第(3)步完成后，將第(3)步收集的反應液，進行過濾，棄濾液，收集濾渣，對于收集的濾渣，用pH 3 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌3 5次，分別收集洗滌液和洗滌渣，對于收集的洗滌渣，在溫度為-40 _50°C、真空度為20 50Pa的條件下，進行冷凍干燥24 30小時，就制備出殼聚糖-精氨酸樹脂共固定化G0D/CAT微球。
2.按照權利要求
1所述的一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，其特征在于 第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 1，將GOD和CAT溶解于pH 3的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中； 第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 3mL,攪拌吸附30分鐘后，戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 5，在4°C下，反應2小時； 第(4)步中，用pH 3的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌3次，冷凍干燥機的溫度為-40°C、真空度為20Pa,進行冷凍干燥24小時。
3.按照權利要求
1所述的一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，其特征在于 第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 4，將GOD和CAT溶解于pH 5的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中； 第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 5mL，攪拌吸附45分鐘后，戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 7，在7°C下，反應2. 5小時； 第(4)步中，用pH 5的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌4次，冷凍干燥機的溫度為_45°C、真空度為35Pa，進行冷凍干燥27小時。
4.按照權利要求
1所述的一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，其特征在于 第⑵步中，GOD CAT的活力比為1: 6，將GOD和CAT溶解于pH 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中； 第(3)步中，第(I)步制備出的殼聚糖-精氨酸陰離子微球的質量第(2)步收集的含GOD和CAT的混合溶液的體積比為Ig 8mL,攪拌吸附60分鐘后，戊二醛體積濃度為2. 5%的戊二醛溶液含GOD和CAT的混合溶液的體積比為1: 10，在10°C下，反應3小時； 第(4)步中，用pH 8的O. 2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液液洗滌5次，冷凍干燥機的溫度為_50 °C、真空度為50Pa，進行冷凍干燥30小時。
專利摘要
一種制備共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶微球的方法，屬于固定化酶技術領域：
。本發明以殼聚糖-精氨酸陰離子微球為載體，加入GOD和CAT混合溶液及戊二醛，經交聯反應、過濾、洗滌、冷凍干燥，制備出共固定化GOD和CAT微球。本發明具有方法反應條件溫和，酶活力回收較高，固定化酶半衰期長，操作簡單，成本較低，清潔安全等特點。采用本發明方法制備出的產品，可廣泛應用于醫藥、食品，水處理、水泥等行業中。還能作為除葡萄糖、脫氧、殺菌劑、葡萄糖定量分析試劑等。
文檔編號C12N11/18GKCN102199592 B發布類型授權 專利申請號CN 201110084111
公開日2013年4月3日 申請日期2011年4月2日
發明者周小華, 王穎利, 康宏寬, 付雪梅, 周興 申請人:重慶大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),