專利名稱:一種利用歐文氏桿菌提取β-甘露聚糖酶的工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及同一發酵液通過分流同時制備菌劑和酶制劑的工藝。菌劑主要用于草本纖維的提取與精制，包括紡織行業的麻類生物脫膠、造紙行業的生物制漿以及酒精生產行業的草本纖維原料生物糖化；β -甘露聚糖酶在食品、醫藥、飼料、造紙、紡織印染、石油開采及生物技術研究等多方面得到廣泛運用。
背景技術：
(一)國內外發展現狀與趨勢
1、開發草本纖維資源是全球發展趨勢
伴隨石油和森林資源的短缺以及人類生活質量的提高，國內外紡織和造紙行業正在興起草本纖維資源開發利用的熱潮。草本纖維除了用作紡織原料以外，近年來開發出了建材、高檔紙漿、汽車零部件、裝飾材料、可降解農膜等多種新產品，開發利用潛力極大。目前，俄羅斯、埃及等亞麻主產國正在加緊亞麻產業的發展；美國、日本、法國、比利時、意大利等發達國家正在發展紅麻產業；印度尼西亞、馬來西亞等國紛紛引種苧麻；菲律賓、巴西、 新西蘭等熱帶國家正在大力開發龍舌蘭麻、菠蘿麻等麻類纖維的新用途；印度、孟加拉正在加緊黃麻服飾的研制，基本形成了 “以麻補棉”和“以草代木”的態勢。
2、微生物發酵是草本纖維提取與精制的發展方向
國際上正在或可能開發的草本纖維植物涉及19科37屬200多個種，其纖維多包裹在植株的莖桿或葉片中。這些天然草本纖維原料不僅包括大量含糖量極低的非鍵合型物質，如角質化程度很高的表皮，而且含有20% -30%的成分復雜并與纖維素鍵合的非糖類物質，如果膠、木質素等，很難采用簡單方法糖化。在提取草本纖維素方面，傳統的天然水慪制方法存在周期長、不適宜大規模生產、污染空氣、影響水產業發展等問題，常規化學脫膠或制漿方法存在消耗大量化工原料和能源、損傷纖維產量與品質、嚴重污染環境等問題，制約了草本纖維開發利用產業的發展。為此，國內外正在廣泛開展“生物脫膠”和“生物制漿” 工藝的研究。由于麻類等草本纖維原料中非纖維素物質的成分復雜、結構牢固，而微生物產酶的種類和數量難盡人意，酶制劑的應用成本太高而且因為降解非纖維素的機制不清楚以至于處理效果不理想，菌制劑的功能不強而且發酵周期偏長，所以，盡管開展生物法提取與精制麻類纖維的研究歷史長達80年之久，但真正達到生產實用水平的成果，國外的報道還十分罕見。究其原因，就是針對麻類等草本纖維原料非纖維素物質的成分與結構特點而采取基因工程手段定向改良菌種的工作做得太少。
3、甘露聚糖酶的用途日趨廣泛
β -甘露聚糖酶(β -1，4-D-mannanohydrolase)，是一類能水解含有 β _1，4-D-甘露糖苷鍵的甘露聚糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖、半乳葡甘聚糖等)的內切酶，屬于半纖維素酶類。隨著對自然界半纖維素資源的開發和甘露寡糖藥用價值的發現， β-甘露聚糖酶的研究和開發已進入了一個新高潮，它已在食品、飼料、醫藥、造紙、紡織印染、石油開采及生物技術研究等多方面得到廣泛運用。微生物是產生甘露聚糖酶的重要來源。已報道提取甘露聚糖酶的常見類群包括細菌中的芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌， 真菌里的曲霉、木霉、酵母、青霉、梭胞菌、多孔菌、核盤菌和放線菌的鏈霉菌等。
( 二)本發明形成的技術基礎
1、中國率先突破了生物脫膠與生物制漿的技術難關
中國農業科學院麻類研究所連續35年專業從事麻類生物脫膠與生物制漿技術研究，積累了豐富的經驗和資料，造就了一大批專業技術人才，選育出100多株具有特殊功能的菌種，研究形成了 14項處于國內外領先水平科技成果，率先突破了麻類生物脫膠和草類生物制漿的技術難關。同時，創建了農業部麻類遺傳改良與工程微生物重點開放實驗室、國家麻類脫膠與制漿微生物菌種保藏中心、湖南省麻類遺傳育種及麻產品生物加工重點實驗室、麻類加工生物制劑中試車間等技術創新平臺。
2、本發明申請前形成的相關專利技術
中國農業科學院麻類研究所作為專利權人，已經獲得授權的發明專利包括(1) 苧麻細菌化學聯合脫膠技術，專利號ZL85103481 ;(2)苧麻生物脫膠工藝綜合治廢方法與設備，專利號:ZL90105510. 7 ； (3)苧麻生物脫膠工藝技術與設備，專利號ZL95112564. 8 ； (4)草本纖維工廠化脫膠或制漿用高效菌劑制備工藝，專利號ZL02108820.9。已經申請的發明專利(含在審專利)包括(1) 一種紅麻脫膠生物制劑制備工藝，申請號01145354. 0 ； (2) —種高效節能清潔性紅麻韌皮生物制漿工藝，申請中國發明專利并已公布，公開號 CN1451815A ;(3)工廠化條件下龍須草/紅麻韌皮生物制漿工藝，申請中國發明專利并已公布，公開號CN1517486A;(4)高效低耗清潔型麥草生物制漿工藝，申請中國發明專利并已進入實審階段，申請號200410046963. 1。
3、基因工程手段改良歐文氏桿菌取得顯著進展
在已經獲得國家發明專利一苧麻生物脫膠工藝技術與設備的基礎上，采用基因工程手段對T85-260菌株進行改良，獲得了一個對草本纖維原料中非纖維素降解具有高效性和廣譜性的歐文氏桿菌變異菌株CXJZ95-198。
近期研究結果表明，將該菌株制成液態菌劑替代已有專利技術制備的高效菌劑在工廠使用的效果十分理想；測定7. 5h發酵液中β-甘露聚糖酶酶活達到99. 4U/ml，將提取 CXJZ菌劑時分流出來的發酵液經過超濾一鹽析一有機溶劑分離一柱層析純化等程序處理， 獲得甘露聚糖酶樣品，純化甘露聚糖酶樣品的活性達到1490U/ml，因此，形成了采用國際先進的關鍵性工藝設備將CXJZ菌株發酵液分流，同時制備脫膠與制漿高效菌劑及 β-甘露聚糖酶的工藝。該工藝不僅降低了草本纖維原料工廠化脫膠與制漿菌劑的生產成本，而且表明利用同一發酵液制備甘露聚糖酶具有活性高、成本低、來源穩定、提取方便等明顯優點。
4、與國內外同類技術產品的質量性能比較
(1)草本纖維原料脫膠或制漿高效液態菌劑
國內外關于麻類脫膠生物制劑的研究報道很少，印度Bhattacharyya S. K. (1992) 報道了用4種細菌混合培養物處理黃麻7天，孟加拉Mohiuddin G. Shamsul Haque (1998)報道了利用真菌過培養物(粗酶液)處理hard bark(脫膠不完全的基部)5天可以達到脫膠的目的。草本纖維原料脫膠或制漿高效菌劑只需處理7h即可達到脫膠或制漿的目的，不僅時間短得多，而且處理原料種類也多得多，即本項目產品具有明顯的“高效性”和“廣譜性”
4優勢。
(2)甘露聚糖酶制劑
國內外關于甘露聚糖酶的研究報道遠不及淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶多，尤其是投入工業化生產的報道更少。
表1本項目甘露聚糖酶制劑性能與國內外代表性報道結果比較
序號甘露聚糖酶來源發酵周期發酵液酶活精制酶活1歐文氏桿菌7h170u / ml2000u / mlck-1畢赤酵母基因工程菌(HBM047)62h1 OOOu / mlck-2嗜堿芽孢桿菌46h500u / mlck-3Aspergillus niger96h150u / mlck-4BaciIluss. Iicheniformis36h260u / ml
本項目研制出的甘露聚糖酶制劑不僅活力高，而且發酵周期極短，即生產成本大幅度降低。
5、擬解決的實際問題
(1)集中制備菌劑以降低實施生物脫膠與生物制漿工藝的技術難度
1985年研究形成第一代苧麻生物脫膠技術一一苧麻細菌化學聯合脫膠技術曾經在5家企業得到推廣應用。導致后來停產的原因之一是因為企業難以掌握菌種制備技術， 尤其是菌種退化或變異的技術問題難以解決。事實上，國外沒有生物脫膠技術用于大規模生產的成功先例可借鑒，國內麻類脫膠與草類制漿企業大多還是采用化學方法，因此，要實施生物脫膠與生物制漿工藝，菌種制備難免不是一個制約因子。本發明采用集中制備菌劑提供給企業應用可以大幅度降低企業實施生物脫膠與生物制漿工藝的技術難度。
(2)同一發酵液提取菌體及其分泌物以降低產品加工成本
國內外選育甘露聚糖酶高產菌株的研究起步比較晚、成效比較少，所以，盡管甘露聚糖酶的市場前景很好，但是由于加工成本比較高以至于產業發展比較慢。同時，相對于紡織、造紙等行業來說，麻類脫膠與草類制漿只是一個從草本纖維原料中提取纖維的初步加工過程，如果高效菌劑生產成本過高，必然導致終產品缺乏市場價格方面的競爭力。本發明根據市場需求和已有珍稀資源，采用國際先進的關鍵性工藝設備分流同一發酵液提取菌體及其分泌物，可以大幅度降低麻類脫膠與草類制漿專用菌劑和甘露聚糖酶的加工成本。

發明內容
(一 )整體技術方案
本發明采用國際先進的關鍵性工藝設備，如自動控制發酵罐、超濾、柱層析裝置等，對歐文氏桿菌變異菌株CXJZ95-198的發酵液進行分流后，分別精制成高效液態菌劑和甘露聚糖酶。技術方案包括原種活化、一級種子、二級種子、發酵、蛋白酶抑制、粗分離、微濾、超濾、鹽析、溶析、層析、洗滌、配方、真空包裝工序以及濃縮高效液態菌劑和甘露聚糖酶
產品ο
(二)具體
發明內容
1、原種活化
原種活化，取CXJZ95-198典型菌落接種到普通葡萄糖營養肉湯培養基，在120r/ min-180r/min、33°C _:35°C下振蕩培養5. Oh-5. 5h獲得種子菌液。
2、一級種子培養
將活化CXJZ95-198種子菌液接種到實驗室用通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是葡萄糖、魔芋粉、蛋白胨、牛肉膏、NaCl的濃度依次為0. 5%、0. 2%, 0. 5 %、0. 5 %、0. 5 %，自然 pH 值，接種量 2 %，溫度 31 °C -35 °C，通氣量為 0. 2dm3/L-0. 8dm3/ L，攪拌速率為180r/min-260r/min，培養時間5_7h。
3、二級種子培養
將一級種子培養液接種到普通通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是豆餅粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的濃度依次為 1. 0 %、0· 2 %、0· 05 %、 0. 05 %、0. 05 %，自然 ρΗ 值，接種量 2 %，溫度 31°C -35 V，通氣量為 0. 2dm3/L-0. 8dm3/L,攪拌速率為180r/min-260r/min，培養時間5H
4、發酵
將二級種子培養液接種到普通通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是豆餅粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的濃度依次為 1. 5 %、0· 3 %、0· 05 %、 0. 05 %、0. 05 %，自然ρΗ值，溫度31 V -35 V，通氣量為0. 4dm3/L-l. 2dm3/L,攪拌速率為 180r/min-220r/min，接種量5%，發酵7_8h，發酵液甘露聚糖酶活力180U/ml以上。
5、蛋白酶抑制
發酵結束時向發酵液里添加適量蛋白酶抑制劑，以終止發酵并保護胞外酶活性。
6、粗分離
成熟的發酵液采用5 μ m粗濾膜進行固液分離，棄去大于5 μ m的固形物。
7、微濾
以0. 2 μ m微濾膜對小于5 μ m的液相分流物進一步分離，并濃縮大于0. 2 μ m分流物10-15倍。
8、洗滌
采用適量8. 5g/L的生理鹽水對大于0. 2 μ m固形物進行反復洗滌，直至無可溶性糖類物質，獲得濃縮高效菌液。
(以上7-8合稱“濃縮高效菌液精制”)
9、超濾
采用不同分子量IOOkD-IOkD的膜包對小于0. 2 μ m的液相分流物進行超濾濃縮， 濃縮倍數為15-25倍。
10、鹽析
采用硫酸銨分級沉淀法對分子量在IOOkD-IOkD的蛋白質進行分離獲得甘露聚糖酶液，硫酸銨飽和度的范圍是45^-70 ^
11、溶析[0055]采用丙酮沉淀法進一步純化硫酸銨沉淀物，丙酮對甘露聚糖酶液的比例范圍是 1. 2 1-1.8 1。
12、層析
采用kphadex G_100凝膠層析柱進一步純化丙酮沉淀法獲得的甘露聚糖酶液，最終獲得層析純甘露聚糖酶液。
(以上9-12合稱“甘露聚糖酶液精制”)
13、配方
添加適量常規防腐劑、添加劑對濃縮高效菌液以及層析純甘露聚糖酶液予以保護。
14、真空包裝
將配方后的濃縮高效菌液以及層析純甘露聚糖酶液分裝于相應容器，加蓋并裝入塑料真空包裝袋，采用真空包裝機抽氣、密封。
15、濃縮高效液態菌劑
濃縮高效液態菌劑呈淡黃綠色液體，無味，活菌量達到KTcfu/ml，適用于苧麻、紅麻、亞麻、羅布麻、黃麻進行生物脫膠和龍須草、紅麻韌皮、麥草、煙梗進行生物制漿以及草本纖維原料生產酒精的生物糖化加工工藝。
16、甘露聚糖酶
濃縮液態甘露聚糖酶呈褐色或棕褐色的液體，具有酸的特殊氣味，酶活力在 2000U/ml以上，含菌量彡lOOOOcfu/ml，廣泛用于食品、醫藥、飼料、造紙、紡織、石油開采等工業領域。
(三)本發明創新點
在國內外率先選育出對草本纖維原料非纖維素物質降解具有高效性和廣譜性的歐文氏桿菌變異菌株CXJZ95-198，由此深入研究形成了一系列處國際領先水平的發明專利和鑒定成果。本項目進一步利用該菌株生產甘露聚糖酶制劑，在國內外均未見報道。甘露聚糖酶制劑的活力比來源于基因工程菌株并投入規模化生產的產品提高1倍。同時，所用菌株產酶的發酵周期僅需幾左右，這在國內外都未見報道。采用國際先進的關鍵性工藝設備對同一發酵液進行分流后分別精制出菌劑和酶制劑，不僅在微生物工業史上開創了同一發酵液提取菌體及其分泌物兩類產品的先例，而且大幅度提升了微生物產品在生產成本方面的競爭力。本發明的主要創新點包括一級種子培養、二級種子培養、發酵、粗分離、濃縮高效菌液精制、甘露聚糖酶液精制工藝環節以及濃縮高效液態菌劑和甘露聚糖酶產品，具體內涵是
1、一級種子培養
將活化CXJZ95-198種子菌液接種到實驗室用通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是葡萄糖、魔芋粉、蛋白胨、牛肉膏、NaCl的濃度依次為0. 5%、0. 2%, 0. 5 %、0. 5 %、0. 5 %，自然 pH 值，接種量 2 %，溫度 31 °C -35 °C，通氣量為 0. 2dm3/L-0. 8dm3/ L，攪拌速率為180r/min-260r/min，培養時間5_7h。
2、二級種子培養
將一級種子培養液接種到普通通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是豆餅粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的濃度依次為 1. 0 %、0· 2 %、0· 05 %、0. 05 %、0. 05 %，自然 pH 值，接種量 2 %，溫度 31°C -35 V，通氣量為 0. 2dm3/L-0. 8dm3/L,攪拌速率為180r/min-260r/min，培養時間5H
3、發酵
將二級種子培養液接種到普通通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是豆餅粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的濃度依次為 1. 5 %、0· 3 %、0· 05 %、 0. 05 %、0. 05 %，自然ρΗ值，溫度31 V -35 V，通氣量為0. 4dm3/L-l. 2dm3/L,攪拌速率為 180r/min-220r/min，接種量5%，發酵7_8h，發酵液甘露聚糖酶活力180U/ml以上。
4、粗分離
成熟的發酵液采用5u粗慮膜進行固液分離，棄去大于5u的固形物。
5、濃縮高效菌液精制
以0. 2 μ m微濾膜對小于5 μ m的液相分流物進一步分離，并濃縮大于0. 2 μ m分流物10-15倍；采用適量8. 5g/L的生理鹽水對大于0. 2 μ m固形物進行反復洗滌，直至無可溶性糖類物質，獲得濃縮高效菌液。
6、甘露聚糖酶液精制
采用不同分子量IOOkD-IOkD的膜包對小于0. 2 μ m的液相分流物進行超濾濃縮， 濃縮倍數為15-25倍；采用硫酸銨分級沉淀法對分子量在IOOkD-IOkD的蛋白質進行分離獲得甘露聚糖酶液，硫酸銨飽和度的范圍是45% -70% ；采用丙酮沉淀法進一步純化硫酸銨沉淀物，丙酮對甘露聚糖酶液的比例范圍是1. 2 1-1.8 1采用kphadex G-100凝膠層析柱進一步純化丙酮沉淀法獲得的甘露聚糖酶液，最終獲得層析純甘露聚糖酶液。
7、濃縮高效液態菌劑
濃縮高效液態菌劑呈淡黃綠色液體，無味，活菌量達到KTcfu/ml，適用于苧麻、紅麻、亞麻、羅布麻、黃麻進行生物脫膠和龍須草、紅麻韌皮、麥草、煙梗進行生物制漿以及草本纖維原料生產酒精的生物糖化加工工藝。
8、甘露聚糖酶
濃縮液態甘露聚糖酶呈褐色或棕褐色的液體，具有酸的特殊氣味，酶活力在 2000U/ml以上，含菌量彡lOOOOcfu/ml，廣泛用于食品、醫藥、飼料、造紙、紡織、石油開采等工業領域。
四、


1-原種；2—活化；3— —級種子；4— 二級種子；5—發酵；6—蛋白酶抑制； 7—粗分離；8-微濾；9-超濾；10-鹽析；11-溶析；12-層析；13-洗滌；14-配方； 15-真空包裝；16-菌劑；17-甘露聚糖酶。
五具體實施方式
(一 )技術方案
本發明涉及的技術方案包括原種活化、種子培養、發酵、蛋白酶抑制、粗分離、微濾、超濾、鹽析、溶析、柱層析、配方、包裝等工藝步驟(工序)。
1、原種活化
原種活化，取CXJZ95-198典型菌落接種到普通葡萄糖營養肉湯培養基，在120r/
8min-180r/min、33°C _:35°C下振蕩培養5. Oh-5. 5h獲得種子菌液。
2、一級種子培養
將活化CXJZ95-198種子菌液接種到實驗室用通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是葡萄糖、魔芋粉、蛋白胨、牛肉膏、NaCl的濃度依次為0. 5%、0. 2%, 0. 5 %、0. 5 %、0. 5 %，自然 pH 值，接種量 2 %，溫度 31 °C -35 °C，通氣量為 0. 2dm3/L-0. 8dm3/ L，攪拌速率為180r/min-260r/min，培養時間5_7h。
3、二級種子培養
將一級種子培養液接種到普通通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是豆餅粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的濃度依次為 1. 0 %、0· 2 %、0· 05 %、 0. 05%、0. 05%，自然 ρΗ 值，接種量 2%，溫度 31°C _:35°C，通氣量為 0. 2dm3/L-0. 8dm3/L，攪拌速率為180r/min-260r/min，培養時間5H
4、發酵
將二級種子培養液接種到普通通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是豆餅粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4、MgSO4 · 7H20 的濃度依次為 1. 5 %、0· 3 %、0· 05 %、
0.05 %、0. 05 %，自然ρΗ值，溫度31 V -35 V，通氣量為0. 4dm3/L-l. 2dm3/L,攪拌速率為 180r/min-220r/min，接種量5%，發酵7_8h，發酵液甘露聚糖酶活力180U/ml以上。
5、蛋白酶抑制
發酵結束時向發酵液里添加適量蛋白酶抑制劑，以終止發酵并保護胞外酶活性。
6、粗分離
成熟的發酵液采用5 μ m粗濾膜進行固液分離，棄去大于5 μ m的固形物。
7、微濾
以0. 2 μ m微濾膜對小于5 μ m的液相分流物進一步分離，并濃縮大于0. 2 μ m分流物10-15倍。
8、洗滌
采用適量8. 5g/L的生理鹽水對大于0. 2 μ m固形物進行反復洗滌，直至無可溶性糖類物質，獲得濃縮高效菌液。
9、超濾
采用不同分子量IOOkD-IOkD的膜包對小于0. 2 μ m的液相分流物進行超濾濃縮， 濃縮倍數為15-25倍。
10、鹽析
采用硫酸銨分級沉淀法對分子量在IOOkD-IOkD的蛋白質進行分離獲得甘露聚糖酶液，硫酸銨飽和度的范圍是45^-70 ^
11、溶析
采用丙酮沉淀法進一步純化硫酸銨沉淀物，丙酮對甘露聚糖酶液的比例范圍是
1.2 1-1.8 1。
12、層析
采用kphadex G_100凝膠層析柱進一步純化丙酮沉淀法獲得的甘露聚糖酶液，最終獲得層析純甘露聚糖酶液。
13、配方[0113]添加適量常規防腐劑、添加劑對濃縮高效菌液以及層析純甘露聚糖酶液予以保護。
14、真空包裝
將配方后的濃縮高效菌液以及層析純甘露聚糖酶液分裝于相應容器，加蓋并裝入塑料真空包裝袋，采用真空包裝機抽氣、密封。
(二)實驗規模與地點
本實施例在實驗室條件下進行，發酵批量為12L/罐；實驗地點中國農業科學院麻類研究所。
(三)實施效果
1、草本纖維原料脫膠或制漿濃縮高效液態菌劑
采用16L自動控制發酵罐以及上述技術方案試驗200多次，生產高效液態菌劑將近200kg，即每罐發酵液(12L)可生產高效液態菌劑lkg。產品主要技術規格如表2所示。這些菌劑除了在實驗室用于紅麻韌皮、麥草的生物制漿技術研究以外，大量用于工廠化條件下苧麻、亞麻、紅麻生物脫膠試驗。工廠化應用試驗結果顯示，與常規化學脫膠或制漿工藝比較，①燒堿用量減少70%以上；②動力能耗節省20%以上；③細漿得率提高5個百分點； ④工業綜合廢水水質單一，直接進入生物氧化處理且易于達標，污水處理成本節省約60%。
表2菌劑的主要技術規格
權利要求
1.一種利用歐文氏桿菌變異菌株CXJZ95-198提取β-甘露聚糖酶的工藝，包括以下步驟(1)一級種子培養將歐文氏桿菌變異菌株CXJZ95-198活化菌液接種到實驗室用通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是葡萄糖、魔芋粉、蛋白胨、牛肉膏、NaCl，濃度依次為0. 5%,0. 2%,0. 5%,0. 5%,0. 5%,自然pH值，接種量2%，溫度31°C 35°C，通氣量為0. 2dm3/L 0. 8dm3/L，攪拌速率為180r/min 260r/min，培養時間5 7h ；(2)二級種子培養將一級種子培養液接種到普通通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置，配方是豆餅粉、魔芋粉、NH4H2PO4, K2HPO4, MgSO4 · 7H20的濃度依次為1.0%, 0. 2%,0. 05%,0. 05%,0. 05%,自然pH值，接種量2%，溫度 31°C 35°C，通氣量為 0. 2dm3/ L 0. 8dm3/L，攪拌速率為180r/min 260r/min，培養時間5 7h ；(3)發酵將二級種子培養液接種到普通通氣攪拌式發酵罐中，培養基以自來水配置， 配方是豆餅粉、魔芋粉、NH4H2PO4、K2HP04、MgSO4 ·7Η20的濃度依次為1. 5%,0. 3%,0. 05%, 0. 05 %、0. 05 %，自然ρΗ值，溫度31 °C 35 °C，通氣量為0. 4dm3/L 1 · 2dm3/L，攪拌速率為 180r/min 220r/min，接種量5%，發酵7 8h，發酵液β-甘露聚糖酶活力180U/ml以上；(4)粗分離將成熟的發酵液采用5μ m粗濾膜進行固液分離，棄去大于5 μ m的固形物；(5)濃縮高效菌液精制以0.2 μ m微濾膜對小于5 μ m的液相分流物進一步分離，并濃縮大于0. 2 μ m分流物10 15倍；采用適量8. 5g/L的生理鹽水對大于0. 2 μ m固形物進行反復洗滌，直至無可溶性糖類物質，獲得濃縮高效菌液；(6)β-甘露聚糖酶液精制采用不同分子量IOOkD IOkD的膜包對小于0.2μπι的液相分流物進行超濾濃縮，濃縮倍數為15 25倍；采用硫酸銨分級沉淀法對分子量在 IOOkD IOkD的蛋白質進行分離獲得β-甘露聚糖酶液，硫酸銨飽和度的范圍是45% 70% ；采用丙酮沉淀法進一步純化硫酸銨沉淀物，丙酮對β-甘露聚糖酶液的比例范圍是 1.2 1 1.8 1 ；采用S印hadexG-100凝膠層析柱進一步純化甘露聚糖酶液，最終獲得層析純β-甘露聚糖酶液。
2.如權利要求
1所述的一種利用歐文氏桿菌變異菌株CXJZ95-198提取β-甘露聚糖酶的工藝，所述濃縮高效菌液呈淡黃綠色液體，無味，活菌量達到liTcfu/ml。
3.如權利要求
1所述的一種利用歐文氏桿菌變異菌株CXJZ95-198提取β-甘露聚糖酶的工藝，所述層析純β “甘露聚糖酶液呈褐色或棕褐色液體，具有酸的特殊氣味，酶活力在 2000U/ml 以上，含菌量< 10000cfu/ml。
專利摘要
本發明涉及生物制劑行業一種利用歐文氏桿菌提取β-甘露聚糖酶的工藝。其技術方案包括原種活化、一級種子培養、二級種子培養、發酵、蛋白酶抑制、粗分離、濃縮高效菌液精制、甘露聚糖酶液精制、配方、真空包裝工藝環節以及濃縮高效液態菌劑和甘露聚糖酶產品。該發明采用集中制備菌劑方案可以降低實施生物脫膠與生物制漿工藝的技術難度，從同一發酵液提取菌體及其分泌物可以降低產品加工成本。采用本發明技術方案生產的濃縮高效液態菌劑適用于麻類生物脫膠和草類生物制漿以及草本纖維原料生產酒精的生物糖化加工工藝；甘露聚糖酶廣泛用于食品、醫藥、飼料、造紙、紡織、石油開采工業領域。
文檔編號C12N9/24GKCN1978636 B發布類型授權 專利申請號CN 200510032497
公開日2011年9月21日 申請日期2005年12月5日
發明者馮湘沅, 劉正初, 張運雄, 彭源德, 段盛文, 胡鎮修, 鄭科 申請人:中國農業科學院麻類研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),