本發明屬于(yu)微生物應(ying)用，尤其(qi)涉(she)及一種(zhong)灰白異柄菌細胞(bao)系及其(qi)應(ying)用。

背景技術：

1、原生(sheng)動(dong)物(wu)(wu)(wu)是自(zi)然界中(zhong)一類特殊的(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)，其(qi)(qi)在地球出現的(de)(de)時間較早，網柄(bing)(bing)細(xi)(xi)胞狀黏菌(jun)(jun)簡稱網柄(bing)(bing)菌(jun)(jun)，是諸多原生(sheng)動(dong)物(wu)(wu)(wu)中(zhong)較為獨特的(de)(de)物(wu)(wu)(wu)種，其(qi)(qi)無(wu)性生(sheng)活(huo)史(shi)包括了單(dan)細(xi)(xi)胞捕食細(xi)(xi)菌(jun)(jun)，單(dan)細(xi)(xi)胞聚集形(xing)成多細(xi)(xi)胞的(de)(de)集群(qun)(qun)，集群(qun)(qun)再通(tong)過分化(hua)形(xing)成柄(bing)(bing)細(xi)(xi)胞與(yu)孢(bao)子的(de)(de)特殊生(sheng)命活(huo)動(dong)過程，因此網柄(bing)(bing)菌(jun)(jun)具有(you)重(zhong)要研究意義，但長久以來其(qi)(qi)培(pei)養(yang)方式始終限制其(qi)(qi)被(bei)利用，僅盤基(ji)網柄(bing)(bing)菌(jun)(jun)通(tong)過馴化(hua)可進行(xing)無(wu)飼的(de)(de)純培(pei)養(yang)，但其(qi)(qi)遺傳(chuan)背景較為單(dan)一，因此培(pei)育新(xin)的(de)(de)網柄(bing)(bing)菌(jun)(jun)細(xi)(xi)胞系具有(you)重(zhong)要意義和價(jia)值。

技術實現思路

1、本(ben)發明要解(jie)決的技術問題(ti)是傳統的盤基(ji)網柄(bing)(bing)菌(jun)網柄(bing)(bing)菌(jun)遺傳背景較為單一。

2、本發明采(cai)用的技術方案如下：一(yi)種(zhong)灰白異柄菌(jun)(heterostelium?pallidum)細胞系，命名為(wei)(wei)ha-1，保(bao)藏(zang)編(bian)號為(wei)(wei)cctcc?no:c202423，保(bao)藏(zang)日(ri)(ri)期(qi)為(wei)(wei)2024年1月22日(ri)(ri)，保(bao)藏(zang)地點為(wei)(wei)：中(zhong)國典型培養物保(bao)藏(zang)中(zhong)心。

3、灰白異柄(bing)(bing)菌(heterostelium?pallidum)ha-1的(de)生(sheng)(sheng)物學特征(zheng)為(wei)：孢(bao)(bao)堆果常單生(sheng)(sheng)或聚生(sheng)(sheng)，偶有(you)簇(cu)生(sheng)(sheng)，多(duo)平伏，大(da)小為(wei)1.9～9.0mm；孢(bao)(bao)堆果柄(bing)(bing)無(wu)色、嬌弱、彎曲、前端距離短；具有(you)頂(ding)生(sheng)(sheng)孢(bao)(bao)子團，頂(ding)部細(xi)胞呈細(xi)尖形(xing)；基部棒狀膨大(da)，基部至頂(ding)部漸細(xi)；具有(you)規則的(de)輪生(sheng)(sheng)分枝，輪生(sheng)(sheng)支數(shu)2～10個，每輪具3～7個分枝，分枝的(de)基部至頂(ding)部漸細(xi)，長為(wei)75～210μm；孢(bao)(bao)子團呈白色的(de)球形(xing)，直徑為(wei)25～90μm；孢(bao)(bao)子呈透明的(de)長橢圓形(xing)，大(da)小為(wei)3.5～5.0×5.0～8.0μm。

4、一種灰白異(yi)柄菌細胞系(xi)的培養方法，包括(kuo)以下步驟(zou)：

5、步驟(zou)一，土壤分離：

6、稱取(qu)土(tu)壤(rang)(rang)樣品加入到無菌水中，封口置于恒(heng)溫搖床中震蕩(dang)，靜置形成土(tu)壤(rang)(rang)懸液；

7、取(qu)土壤(rang)懸(xuan)(xuan)液(ye)(ye)與(yu)蒸(zheng)餾水混合，制成土壤(rang)懸(xuan)(xuan)液(ye)(ye)稀釋液(ye)(ye)，取(qu)稀釋液(ye)(ye)與(yu)大腸桿菌涂布到干草瓊脂固(gu)體培養基，置于恒溫培養箱培養，從而獲得(de)灰白異(yi)柄(bing)菌菌株；

8、挑取單(dan)個灰白異柄菌(jun)孢子(zi)團與大腸桿菌(jun)涂布至水瓊脂(zhi)固(gu)體培養(yang)基上(shang)，置于恒(heng)溫培養(yang)箱培養(yang)，得到純(chun)化后灰白異柄菌(jun)菌(jun)株。

9、步驟二，無(wu)飼細胞培養：

10、(1)細(xi)胞獲(huo)得(de)：在純化后的(de)灰(hui)(hui)白(bai)異柄菌形(xing)成孢子團(tuan)后，挑取單個孢子團(tuan)加(jia)入到無菌hl5液體培(pei)養基中(zhong)，再向hl5液體培(pei)養基中(zhong)加(jia)入氨芐青霉素(su)，搖(yao)勻(yun)后置于恒(heng)溫搖(yao)床培(pei)養，獲(huo)得(de)無飼培(pei)養的(de)灰(hui)(hui)白(bai)異柄菌細(xi)胞；

11、(2)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)傳(chuan)(chuan)代(dai)：待(dai)液(ye)體培養基中出現灰白異(yi)(yi)柄(bing)菌細(xi)(xi)胞(bao)(bao)后，取菌液(ye)加入(ru)到新鮮的hl5液(ye)體培養基中，并在(zai)其中加入(ru)氨芐(xia)青霉素(su)，為傳(chuan)(chuan)代(dai)培養；將最初獲得的無飼(si)灰白異(yi)(yi)柄(bing)菌細(xi)(xi)胞(bao)(bao)作(zuo)為原(yuan)代(dai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，記作(zuo)p0代(dai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，在(zai)傳(chuan)(chuan)代(dai)后記作(zuo)p1代(dai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，后續(xu)每(mei)3～4d進行一次傳(chuan)(chuan)代(dai)，記生長代(dai)數；

12、(3)細胞(bao)(bao)凍(dong)存：在p8代(dai)出現細胞(bao)(bao)后，在超凈工作(zuo)臺(tai)中(zhong)取(qu)一定量的菌液進行離心，棄上清，向(xiang)其中(zhong)加(jia)入細胞(bao)(bao)凍(dong)存液吹打(da)混(hun)勻(yun)，令其形(xing)成細胞(bao)(bao)懸(xuan)液，分裝至凍(dong)存管冷凍(dong)過(guo)夜，并最(zui)終置于液氮(dan)中(zhong)長期保存；

13、(4)細(xi)(xi)胞復蘇(su)：取液(ye)氮(dan)中凍存的p8代灰白異柄菌(jun)細(xi)(xi)胞，恒溫水浴令其解凍，在(zai)超凈工作(zuo)臺中吹打(da)(da)，向凍存管中加入hl5液(ye)體培(pei)(pei)養(yang)基，混勻(yun)后(hou)(hou)將其全部打(da)(da)入新鮮的hl5液(ye)體培(pei)(pei)養(yang)基中，并向其中加入氨(an)芐青霉素，搖勻(yun)后(hou)(hou)置(zhi)于恒溫搖床培(pei)(pei)養(yang)，觀察細(xi)(xi)胞生長。

14、進一步地，干草(cao)瓊脂固(gu)(gu)體培(pei)養基的制作方(fang)法為：取狗尾草(cao)，加(jia)入蒸餾水，封口(kou)后高壓(ya)滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)，用(yong)折疊好的紗布過濾滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)后的干草(cao)汁，調(diao)整ph值，隨后向其中加(jia)入瓊脂粉后高壓(ya)滅(mie)(mie)菌(jun)(jun)，在超凈工作臺中將培(pei)養基倒入培(pei)養皿中待(dai)其冷卻后凝(ning)固(gu)(gu)。

15、進一步地(di)，水瓊脂(zhi)固體培(pei)養(yang)基(ji)的制作(zuo)方法為：取(qu)瓊脂(zhi)粉和蒸(zheng)餾(liu)水，高(gao)壓滅(mie)菌(jun)，充分溶解(jie)后分裝，并與玻璃培(pei)養(yang)皿(min)共(gong)同置于(yu)滅(mie)菌(jun)鍋內高(gao)壓滅(mie)菌(jun)，冷卻后于(yu)超(chao)凈(jing)工(gong)作(zuo)臺(tai)內將培(pei)養(yang)基(ji)倒入培(pei)養(yang)皿(min)中，待其冷卻后凝固。

16、進一步地，無菌hl5液體培養基的制(zhi)作方法(fa)為：取胰蛋(dan)白(bai)胨(dong)、明(ming)膠蛋(dan)白(bai)胨(dong)、葡(pu)萄糖(tang)、酵母(mu)浸粉(fen)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和蒸餾水，高壓滅菌。

17、本發明提(ti)供了一種灰白異柄菌細(xi)胞系，具有以(yi)下優點(dian)：

18、可(ke)以進(jin)行無飼培(pei)養的(de)(de)(de)灰白(bai)異(yi)(yi)柄菌(jun)(jun)(jun)(jun)菌(jun)(jun)(jun)(jun)株ha-1，其(qi)形態(tai)與生(sheng)活(huo)史野生(sheng)型(xing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)株無差異(yi)(yi)，提供了可(ke)以用于(yu)廣泛科學研究的(de)(de)(de)新遺(yi)傳背景(jing)的(de)(de)(de)原生(sheng)動物模型(xing)，灰白(bai)異(yi)(yi)柄菌(jun)(jun)(jun)(jun)ha-1可(ke)以捕食(shi)不(bu)(bu)同種類(lei)的(de)(de)(de)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)，且ha-1與ax-2在(zai)(zai)分(fen)類(lei)地位上相(xiang)近，生(sheng)境和生(sheng)活(huo)方(fang)式相(xiang)近，但是在(zai)(zai)捕食(shi)不(bu)(bu)同細(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)能力(li)上存在(zai)(zai)差異(yi)(yi)，因此灰白(bai)異(yi)(yi)柄菌(jun)(jun)(jun)(jun)ha-1在(zai)(zai)研究細(xi)胞吞(tun)噬不(bu)(bu)同細(xi)菌(jun)(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)差異(yi)(yi)上具有(you)加大的(de)(de)(de)潛(qian)力(li)。

技術特征：

1.一(yi)種灰白異柄(bing)菌細胞系，其特征在(zai)于：命名為灰白異柄(bing)菌(heterosteliumpallidum)ha-1，保(bao)藏(zang)(zang)編(bian)號(hao)為cctcc?no:c202423，保(bao)藏(zang)(zang)日期為2024年1月22日，保(bao)藏(zang)(zang)地點為：中(zhong)國典型(xing)培養(yang)物(wu)保(bao)藏(zang)(zang)中(zhong)心。

2.根據權利要求1所述(shu)的(de)(de)一種灰(hui)白異(yi)柄菌細胞系，其(qi)特征(zheng)(zheng)在(zai)于(yu)：可(ke)以進行無飼培養，灰(hui)白異(yi)柄菌(heterostelium?pallidum)ha-1的(de)(de)生物(wu)學(xue)特征(zheng)(zheng)為：孢(bao)堆(dui)(dui)果(guo)常單(dan)生或(huo)聚生，偶有(you)簇生，多平伏；孢(bao)堆(dui)(dui)果(guo)柄無色、嬌(jiao)弱、彎(wan)曲、前端距(ju)離短，具有(you)頂生孢(bao)子團，孢(bao)堆(dui)(dui)果(guo)柄頂部(bu)(bu)細胞呈細尖(jian)形，孢(bao)堆(dui)(dui)果(guo)柄基部(bu)(bu)細胞棒狀膨大，基部(bu)(bu)至頂部(bu)(bu)漸細；具有(you)規則的(de)(de)輪生分枝，分枝的(de)(de)基部(bu)(bu)至頂部(bu)(bu)漸細；孢(bao)子團呈白色，球形；孢(bao)子呈透(tou)明(ming)的(de)(de)長橢圓形。

3.根據權(quan)利要求2所述(shu)的(de)一種灰白(bai)異柄(bing)菌細(xi)胞系的(de)培(pei)養方法(fa)，其特征在于，包括以下步驟：

4.根據(ju)權利(li)要(yao)求3所述(shu)的(de)一種灰白異(yi)柄(bing)菌細(xi)(xi)胞(bao)系(xi)的(de)培養方法(fa)，其特征在于，所述(shu)無飼細(xi)(xi)胞(bao)培養包括(kuo)細(xi)(xi)胞(bao)獲(huo)得、細(xi)(xi)胞(bao)傳代、細(xi)(xi)胞(bao)凍存(cun)和細(xi)(xi)胞(bao)復蘇(su)。

5.根據權利(li)要(yao)求1或2所(suo)述灰白異(yi)柄菌細(xi)胞(bao)系在研究細(xi)胞(bao)吞(tun)噬(shi)不同細(xi)菌中的(de)應用。

技術總結
本發明公開的一種灰白異柄菌細胞系及其應用，本發明屬于微生物應用技術領域，具體是一種可以進行無飼培養的灰白異柄菌菌株HA?1，其形態與生活史野生型菌株無差異，提供了可以用于廣泛科學研究的新遺傳背景的原生動物模型，HA?1可以捕食不同種類的細菌，且灰白異柄菌HA?1與盤基網柄菌AX?2在分類地位上相近，生境和生活方式相近，但是在捕食不同細菌的能力上存在差異。

技術研發人員：劉樸,孫達,葛建華,李玉
受保護的技術使用者：吉林農業大學
技術研發日：
技術公布日：2024/9/19